羊绒在绒山羊毛囊中发育形成,由毛乳头细胞通过多种信号通路来调控其生长和发育,因此毛乳头细胞也被称为是调控毛囊发育和周期的控制中心。内蒙古绒山羊毛囊具有两种类型,包括初级毛囊和次级毛囊。这两种毛囊分别会产生羊毛和羊绒两种不同类型的毛纤维。调控这两种毛囊的生长和发育是多种信号因子相互作用的结果。本实验以阿尔巴斯绒山羊两种毛乳头细胞为模型,研究与绒毛生长相关的Lef1和Msx2基因对毛乳头细胞的增殖作用。1、过表达和干扰载体的构建通过基因片段克隆、酶切和连接等方法,成功构建了 4种载体,分别是Lef1基因过表达载体、Lef1干扰载体、Msx2基因过表达载体和Msx2基因干扰载体。2、阿尔巴斯绒山羊初级和次级毛乳头细胞的培养及鉴定通过常规细胞培养法,本实验成功培养了阿尔巴斯绒山羊的初级和次级毛乳头细胞,并利用荧光免疫法检测毛乳头细胞的特异性标记因子α-SMA和CD133,鉴定本实验所培养的细胞确实为毛乳头细胞。3、Lef1基因的过表达和干扰细胞株的转染及检测通过脂质体转染方法将Lef1基因的过表达载体和干扰载体成功转入阿尔巴斯绒山羊的初级和次级毛乳头细胞中,大量培养后,得到Lef1基因的4种细胞株,分别为Lef1基因过表达的初级和次级毛乳头细胞株,以及Lef1基因干扰的初级次级毛乳头细胞株。Real-time PCR和Western Blot检测Lef1基因及相关基因β-catenin、C-myc和cyclinD1的表达量发现:以未转染任何质粒的细胞作为实验对照组,在初级毛乳头细胞中Lef1过表达和干扰组的表达量分别是对照的9.25和0.2倍。而在次级毛乳头细胞中,Lef1过表达和干扰组的表达量分别是对照的10.53和0.21倍。实验结果表明本实验成功建立了 Lef1基因的四种细胞株。在实验中检测各个样本中Lef1、β-catenin、C-myc和cyclinD1基因的表达情况发现:两种毛乳头细胞中Lef1基因的表达变化与β-catenin、C-myc和cyclinD1基因的表达变化趋势一致。实验结果表明:在两种毛乳头细胞中Lef1基因与β-catenin、C-myc和cyclinD1基因的表达呈正相关性。同时也比较了 Lef1基因的四种细胞株中相关基因的表达情况,结果发现:Lef1、β-catenin、cyclinD1在次级毛乳头细胞中的表达量分别是初级毛乳头细胞的1.28、2.19、1.16倍。而C-myc在次级毛乳头细胞中表达量是初级毛乳头细胞的0.37倍。实验结果表明:与绒毛生长的相关的Lef1、β-catenin、cyclinD1和C-myc基因在两种毛乳头细胞中的表达量是不同的。4.Msx2基因的过表达和干扰细胞株的转染及检测通过脂质体转染方法将Msx2基因的过表达载体和干扰载体成功转入阿尔巴斯绒山羊的初级和次级毛乳头细胞中,大量培养后,得到Msx2基因的4种细胞株,分别为Msx2基因过表达的初级和次级毛乳头细胞株,以及Msx2基因干扰的初级和次级毛乳头细胞株。Real-time PCR和Western Blot检测Msx2基因及相关基因Lef1、BMP-2的表达量发现:以未转染任何质粒的细胞作为实验对照组,在初级毛乳头细胞中Msx2过表达和干扰组的表达量分别是对照的11.85和0.31倍。在次级毛乳头细胞中,Msx2过表达和干扰组的表达量分别是对照的10.59和0.45倍。实验结果表明本实验成功建立了 Msx2基因的四种细胞株。在实验中检测各个样本中Msx2、Lef1和BMP-2基因的表达情况发现:在两种毛乳头细胞中Msx2基因的表达与Lef1和BMP-2基因的表达变化趋势一致。实验结果表明:在毛乳头细胞中Msx2基因的表达与Lef1和BMP-2基因的表达呈正相关性。通过对各细胞株生长情况的观察,发现Lef1和Msx2基因对毛乳头细胞的增殖能力起到正调控作用,Lef1和Msx2基因的干扰使得毛乳头细胞的增殖能力下降。上述实验研究表明:在毛乳头细胞中Lef1基因与β-catenin、C-myc和cyclin D1基因呈正相关性的调控,Msx2基因与Lef1和BMP-2基因呈正相关性的调控,Lef1和Msx2基因对毛乳头细胞的增殖具有正调控作用。