【摘 要】
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目的:观察应用扶正化瘀方后肝脏CD8~+T淋巴细胞及其亚群对共培养的肝星状细胞的影响,探讨扶正化瘀方抗肝纤维化的作用机制。方法:应用流式细胞术分选急性肝损伤小鼠肝脏CD8~+
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目的:观察应用扶正化瘀方后肝脏CD8~+T淋巴细胞及其亚群对共培养的肝星状细胞的影响,探讨扶正化瘀方抗肝纤维化的作用机制。方法:应用流式细胞术分选急性肝损伤小鼠肝脏CD8~+T淋巴细胞及免疫磁珠法分选肝硬化肝移植患者弃肝CD8~+T及其亚群淋巴细胞,经体外给予扶正化瘀方药物血清干预或预先小鼠体内用药,再与肝星状细胞株(小鼠JS 1、人LX-2)以2:1比例共培养于96孔板中,使用q PCR方法检测各组Col.Ⅰm RNA和a-SMA m RNA表达变化,ELISA法检测共培养上清中各组相关细胞因子的含量。统计比较各组的差异。结果:1.第一部分实验自急性肝损伤小鼠分离CD8~+T淋巴细胞与JS 1共培养,显示FZ-组(CD8~+T淋巴细胞先经药物血清温育,共培养时换正常大鼠血清)JS1表达α-SMA m RNA较单JS 1培养的Control组明显减少(P<0.05);与X组(CD8~+T淋巴细胞预温育和共培养时均应用正常大鼠血清)相比,FZ-组JS 1表达Col.Ⅰm RNA明显被抑制,组间差异有统计学意义(P<0.001)。经药物血清温育后,共培养上清中促肝纤维化的因子含量降低,其中FZ-组和FZ组(CD8~+T淋巴细胞预先温育和共培养时均应用FZHY药物血清)IL-13含量均显著低于X组(P<0.05);FZ组的IL-1b含量低,与X组的差异有统计学意义(P<0.01);而抑制肝纤维化的细胞因子含量则有所增加,如FZ-组和FZ组IL-10含量有所增加,但是只有FZ组的IL-10含量与X组间的差异有统计学意义(P<0.05)。FZ组的颗粒酶B含量明显增加,与X组组间差异有统计学意义(P<0.05)。2.第二部分实验显示,急性肝损伤模型(M)组的ALT和AST活性均显著升高,差异有统计学意义(均P<0.0001)。FZ组(小鼠经扶正化瘀方预先用药5d)的ALT活性升高的幅度明显小于M组,差异有统计学意义(P<0.001)。自各组小鼠肝脏分离的CD8~+T淋巴细胞与JS 1共培养48h,M组与Control组(JS 1单培养)相比α-SMA m RNA的表达明显增加(P<0.01);Col.Ⅰm RNA表达也明显高于Control组和N组(正常小鼠肝脏CD8~+T淋巴细胞与JS 1共培养),差异均有统计学意义(均P<0.001)。FZ组α-SMA m RNA和Col.Ⅰm RNA表达显著降低,与M组间的差异,具有统计学意义(均P<0.01)。在48h共培养上清中检测多种细胞因子含量,但是这些检测结果都不支持扶正化瘀方通过影响CD8~+T淋巴细胞分泌细胞因子调控HSC。3.第三部分实验从肝硬化患者移植弃肝分离CD8~+T、CD8~+CD28~+T和CD8~+CD28~-T淋巴细胞,与LX-2共培养。结果显示,与全程用正常大鼠血清温育的X组相比较,FZ-组(CD8~+T淋巴细胞及亚群先经药物血清温育,共培养时换正常大鼠血清)的CD8~+T、CD8~+CD28~+T和CD8~+CD28~-T淋巴细胞均使LX-2减少表达a-SMA m RNA,其中CD8~+CD28~+T淋巴细胞显著降低了LX-2表达α-SMA m RNA(P<0.0001);FZ组(CD8~+T淋巴细胞及其亚群预温育和共培养时均应用药物血清)的CD8~+T、CD8~+CD28~+T和CD8~+CD28~-T淋巴细胞均能显著降低LX-2表达α-SMA的m RNA,与X组和FZ-组间的差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.001或P<0.0001)。FZ-组和FZ组的CD8~+CD28~+T淋巴细胞都抑制了LX-2表达Col.Ⅰm RNA,与X组的差异都有统计学意义(均P<0.05);FZ组的CD8~+T淋巴细胞减少了LX-2表达Col.Ⅰm RNA,与FZ-组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.扶正化瘀方能通过改变小鼠肝脏CD8~+T淋巴细胞功能表型间接抑制活化的HSC,此作用与其分泌的细胞因子的作用关系不大。2.扶正化瘀方除了直接抑制人HSC外,可能还主要通过肝硬化患者肝脏中CD8~+T淋巴细胞的亚群CD8~+CD28~+T淋巴细胞,间接抑制HSC活化。
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