一、研究背景骨骼的发育和稳态依赖于骨形成与骨吸收两个过程,其中骨吸收由单核细胞来源的破骨细胞来介导,未分化间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)来源的成骨细胞则在骨骼发育及骨的形成过程中起着重要作用。在成骨细胞分化过程中,转录因子Runx2/Cbfa1、Osterix(Osx,也称为Sp7)及ATF4高表达或特异性表达于成骨细胞并调控成骨标志物的表达,这些成骨标志物包括碱性磷酸酶(Alp)及骨钙素(Ocn)等。Runx2或Osx基因敲除小鼠不能形成成熟的成骨细胞及骨,因此Runx2与Osx被公认为成骨分化过程中的关键调节因子。Runx2主要表达于肥大前期软骨细胞及成骨细胞,在软骨生成与骨生成中起着多种作用。Osx,又称为sp7,是含有C2H2锌指结构的转录因子,特异性表达于软骨下骨和膜内骨的成骨细胞,处于Runx2/Cbfa1的下游,在成骨细胞分化及小鼠胚胎期、出生后及成年期的骨形成过程中起着必不可少的作用。人工转录因子(Artificial transcription factor,ATF)由DNA结合域、功能域(Effector domain,ED)和核定位信号(Nuclear localization signal,NLS)组成,能有效调控内源性基因的表达。其中,DNA结合域的功能主要是以高特异性、高亲和力识别DNA四联体,功能域则起到激活或抑制靶基因的作用,而核定位信号将人工转录因子携带到细胞核内。DNA结合域最为常见及最有前景的类型为由数个锌指基序构成的人工锌指蛋白(Zinc finger protein,ZFP),其中每个锌指基序由编码两个β折叠和一个ɑ螺旋的大约30个氨基酸构成,每个ɑ螺旋的-1,2,3,6位氨基酸分别与DNA的相互重叠的第3,4,2及1位碱基四联体相互作用,以实现人工转录因子与DNA结合的特异性。为克服在锌指蛋白设计过程中易错及耗时的缺陷,人工转录因子设计软件Zinc Finger Tools应运而生。通过此软件,我们可以方便地寻找到目标DNA序列中适合结合人工转录因子的靶位点及与此靶位点相结合的锌指蛋白序列。锌指蛋白序列与功能域及核定位信号融合后便可形成具有激活或抑制靶基因的功能性人工转录因子。本课题旨在应用在线软件Zinc Finger Tools设计出能特异性激活Osx启动子的人工转录因子并验证该人工转录因子对成骨细胞分化及卵巢摘除术小鼠局部股骨骨量的影响。micrornas(mirnas)属于一类非编码小rna分子,通过与目标mrna分子的3’非翻译区(3’utr)相结合发挥翻译抑制和/或mrna降解的作用。mirnas起源于由数百个核苷酸构成的长序列,此序列经drosha酶和dicer酶处理成约22bp的成熟mirnas。越来越多的证据表明mirnas在发育、稳态及疾病中起着重要作用,许多生理及病理过程如细胞分化、增殖及凋亡过程均需要mirnas的参与。软骨细胞、成骨细胞及破骨细胞中dicer酶的缺乏会导致骨发育及稳态的异常,这表明mirnas在骨骼发育及维持骨稳态方面发挥着重要的作用。大量mirnas被证实能够调节间充质干细胞及成骨细胞的成骨分化。本研究旨在通过targetscan、miranda及pictar等在线软件预测可与osxmrna3’utr结合的mirnas,并研究所预测的mirnas在成骨细胞分化过程的作用及分子机制。肝素结合表皮生长因子(heparin-bindingepidermalgrowthfactor,hbegf)属于表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,egf)家族的成员之一,能够以高亲和力与表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,egfr)结合激活egfr信号通路,包括细胞外信号相关激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,erk)、jnk及磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,pi3k)/akt。egfr信号通路参与许多生理学及病理学过程,包括成骨分化及骨的形成。egfr缺失时,成骨细胞增殖分化异常、骨形成及骨结构受损。而且,hbegf-egfr信号通路能够抑制骨髓间充质干细胞、mc3t3-e1细胞及c2c12细胞向成骨方向分化。二、研究方法1.基于osx为靶点的人工转录因子的设计:通过文献检索的方式查询osx的启动子序列;将此序列输入到人工转录因子在线设计软件zincfingertools(http:www.zincfingertools.org),通过高得分、无位点重叠、高特异性及与转录起始位点的距离等条件选取三个最佳的锌指蛋白(dna结合域);将锌指蛋白氨基酸序列译成核苷酸序列后,与功能域vp64、核定位信号(nls)以及标签ha及酶切位点核苷酸序列组合并优化后,便得到人工转录因子的完整核苷酸序列。2.人工转录因子表达载体的构建及表达:对人工转录因子的核苷酸序列进行全基因合成并构建到pcdna3.1(pcmv-empty)载体中,形成人工转录因子表达载体pcmv-zfp-vp64。westernblot法检测该表达载体转染mc3t3-e1细胞后人工转录因子zfp-vp64的表达情况。3.人工转录因子激活osx启动子能力及与osx启动子结合特异性分析:将表达载体pcmv-zfp-vp64与osx启动子报告载体共转染到mc3t3-e1细胞中,通过双荧光素酶报告分析验证人工转录因子zfp-vp64激活osx启动子的能力,并依此选取三个转录因子中活性最强的一个。然后通过双荧光素酶报告分析、电泳迁移率分析(emsa)及染色质免疫共沉淀(chip)等方法检测该转录因子与osx启动子结合的特异性。4.人工转录因子对成骨细胞分化的影响:将pcmv-zfp-vp64载体转染到成骨细胞内,成骨诱导不同天数后,通过real-timepcr法检测成骨基因alp及ocnmrna水平表达变化;通过alp染色及alizarinred染色检测人工转录因子对成骨细胞碱性磷酸酶活性及钙沉积的影响。5.人工转录因子对卵巢摘除术小鼠局部股骨骨量的影响:将人工转录因子核苷酸序列构建到病毒载体plov.ubic.egfp中,形成人工转录因子病毒载体pubic-zfp-vp64。将pubic-zfp-vp64病毒载体转染到骨髓间充质干细胞中,westernblot法检测人工转录因子的胞内表达情况。经过不同天数的成骨诱导后,real-timepcr法检测成骨标志物alp及ocnmrna的表达变化,alp染色法检测人工转录因子对骨髓间充质干细胞内碱性磷酸酶活性的影响,以确定zfp-vp64对骨髓间充干细胞成骨分化的影响。通过卵巢摘除术构建骨质疏松小鼠模型,并于术后8周及16周进行microct扫描,检测小鼠股骨骨量丢失情况。卵巢摘除术后8周向小鼠左侧股骨骨髓腔注射转染了病毒载体pubic-zfp-vp64的骨髓间充质干细胞,于细胞注射8周后进行microct扫描,检测人工转录因子zfp-vp64对小鼠左侧股骨局部骨量的影响,并通过免疫组织化学方法检测左侧股骨干骺端横断面骨小梁表面细胞的人工转录因子及osx蛋白表达情况。6.基于成骨因子osx为靶点的mirnas预测:通过在线软件targetscan(www.targetscan.org)、miranda(www.microrna.org/microrna/home.do)及pictar(pictar.mdc-berlin.de)预测能与osxmrna3’utr结合的mirnas。7.所预测mirnas与骨密度及成骨细胞分化的相关性:对比卵巢摘除术后16周小鼠与假手术组小鼠股骨mirnas表达情况,以确定所预测mirnas与骨密度的相关性;选取与骨密度有相关性的mirnas,进一步研究其与成骨分化的相关性,即通过real-timepcr法检测成骨细胞及骨髓间充质干细胞成骨诱导过程中该mirnas的表达变化。8.所筛选mirnas对mc3t3-e1细胞及骨髓间充质干细胞成骨分化的影响:将上述筛选的mirnas的功能类似物agomir及功能抑制剂antagomir转染至mc3t3-e1细胞或骨髓间充质干细胞,成骨诱导不同天数后,real-timepcr法检测成骨标志物alp及ocnmrna表达变化,alp染色法检测mirnas对mc3t3-e1细胞及骨髓间充质干细胞内碱性磷酸酶活性的影响。9.所筛选mirnas影响mc3t3-e1细胞成骨分化能力的分子机制探讨:将mirnas与osx3’utr报告载体共转染至mc3t3-e1细胞中,48h后通过双荧光素酶报告分析检测osx3’utr是否为所筛选mirnas的分子靶标,若是,则寻找到该mirnas调控mc3t3-e1细胞成骨分化的分子机制;若否,则进一步通过targetscan、miranda及pictar等软件预测该mirnas的分子靶标,并通过双荧光素酶报告分析验证正确与否,以最终鉴定出该mirnas调控mc3t3-e1细胞成骨分化的分子机制。三、研究结果1.基于osx为靶点的人工转录因子的设计:将osx启动子序列输入到在线软件zincfingertools后,按高得分、无位点重叠、高特异性及与转录起始位点的距离等条件于osx启动子序列中筛选到3个锌指蛋白结合位点(-94/-77、-387/-370及-841/-824),与之相对应的人工锌指蛋白分别为zfp1、zfp2及zfp3,锌指蛋白与功能域vp64、核定位信号nls及检测标签ha结合后分别形成人工转录因子zfp1-vp64、zfp2-vp64及zfp3-vp64。2.人工转录因子激活osx启动子能力及与osx启动子结合特异性分析:人工转录因子表达载体pcmv-zfp1-vp64、pcmv-zfp2-vp64或pcmv-zfp3-vp64与osx启动子报告载体pgl3-osxp共转染mc3t3-e1细胞后,双荧光素酶报告分析结果显示,zfp1-vp64、zfp2-vp64及zfp3-vp64均能使荧光素酶活性显著提高,其中zfp2-vp64作用最为明显,能够使荧光素酶活性提高至空白对照组的约6.9倍。并且,随着pcmv-zfp2-vp64转染剂量的增加,荧光素酶的活性也相应增加,这表明zfp2-vp64能够特异性激活osx启动子。emsa结果显示,标记探针(生物素标记的zfp2结合寡核苷酸序列)能够探测到zfp2-vp64-dna复合体,而变异探针则不能探测到该复合体的存在。而且,随着冷探针剂量的增加,该复合体条带信号逐渐变弱,这表明zfp2-vp64能与osx启动子-387/-370位点特异性结合。为进一步验证两者结合的特异性,我们设计了一对可以扩增osx启动子-465/-270片段(包含-387/-370位点)的引物并实施了chip实验。结果表明,当ha抗体存在时,能够出现预期pcr条带(196bp)。而对照抗体igg存在时,则不能扩增出该条带,这进一步表明zfp2-vp64与osx启动子结合的特异性。3.zfp2-vp64上调osx的表达并促进成骨细胞mc3t3-e1细胞的分化:将不同剂量pcmv-zfp2-vp64载体转染至mc3t3-e1细胞后,real-timepcr结果显示osxmrna水平呈现剂量依赖性增加,westernblot结果显示osx蛋白也呈现剂量依赖性增加,而对照组则未出现显著的osx表达变化。这表明,通过zincfingertools设计的osx启动子特异性人工转录因子zfp2-vp64能够有效激活mc3t3-e1细胞内源性osx的表达。而且,western结果表明,zfp2-vp64能够促进osx下游蛋白atf4的表达,而osx上游蛋白runx2的表达则未出现明显变化。众所周知,osx表达上调能够促进成骨细胞的分化,因此,我们进一步验证了zfp2-vp64对mc3t3-e1细胞成骨分化的影响。将pcmv-zfp2-vp64载体转染至mc3t3-e1细胞并成骨诱导3天及7天后,alp及ocnmrna水平较对照组明显上调;成骨诱导7天后,mc3t3-e1细胞alp染色明显增强;成骨诱导21后,alizarinred染色也明显增强。这些结果表明,zfp2-vp64能够上调osx的表达并促进成骨细胞的分化。4.zfp2-vp64减少卵巢摘除术小鼠股骨局部骨丢失:慢病毒载体pubic-zfp2-vp64转染骨髓间充质干细胞后,细胞可稳定表达zfp2-vp64。zfp2-vp64可上调骨髓间充质干细胞alp及ocnmrna的表达,并可显著增强细胞alp的活性,这提示,zfp2-vp64能够促进骨髓间充质干细胞向成骨方向分化。将转染了pubic-zfp2-vp64载体的骨髓间充干细胞注射到卵巢摘除术小鼠左侧股骨骨髓腔8周后,microct扫描显示zfp2-vp64能够减少左侧股骨的骨丢失,具体表现为小梁骨bmd增加、bv/tv增加、tb.n增加、tb.sp下降。免疫组织化学结果显示,左侧股骨骨小梁表面zfp2-vp64阳性及osx阳性细胞数目明显增加,这提示转染了pubic-zfp2-vp64载体的骨髓间充干细胞在小鼠股骨骨髓腔内分化为成骨细胞,使骨形成速率增加,最终导致卵巢摘除后由雌激素缺乏所诱导的骨量丢失的减少。5.基于osx为靶点的mirnas生物信息学筛选:mir-96与mir-383为targetscan、miranda及pictar三个软件共同预测出的能与osx3’utr结合的mirnas。其中,mir-96在卵巢摘除术小鼠股骨表达下降,mir-383表达水平未出现明显变化。也就是说,mir-96与骨密度成正相关,而mir-383则与骨密度无明显的相关性。这提示mir-96可能在成骨过程中具有生物学作用,故对其进一步研究。6.mir-96促进mc3t3-e1细胞及骨髓间充质干细胞的成骨分化:mir-96在成骨细胞的表达水平明显高于骨髓间充质干细胞。而且,在mc3t3-e1细胞及骨髓间充质干细胞成骨诱导过程中,mir-96表达水平逐渐增加。这提示,mir-96与成骨分化成正相关。将agomir-96转染至mc3t3-e1及骨髓间充质干细胞并成骨诱导后,alp及ocn表达水平上调,alp活性增加;将antagomir-96转染至mc3t3-e1及骨髓间充质干细胞并成骨诱导后,alp及ocn表达水平下调,alp活性减弱。这表明mir-96能够促进MC3T3-E1及骨髓间充质干细胞的成骨分化。7.mi R-96通过抑制HBEGF的表达抑制EGFR信号通路:双荧光素酶报告分析显示,Osx 3’UTR不是mi R-96的分子靶标。通过Target Scan、mi Randa及Pic Tar预测并经双荧光素酶报告分析证实HBEGF 3’UTR为mi R-96的分子靶标。Western blot及real-time PCR结果显示mi R-96能抑制HBEGF蛋白水平表达,对mRNA水平则没有明显影响。而且,mi R-96通过抑制HBEGF的表达起到抑制EGFR信号通路的作用,具体表现在p-EGFR、p-ERK1/2及p-Akt表达水平下调,而总EGFR、总ERK1/2及总Akt表达水平不变。8.HBEGF抑制mi R-96诱导的MC3T3-E1细胞成骨分化:将agomir-96与si-HBEGF共转染至MC3T3-E1细胞并成骨诱导后,si-HBEGF导致的HBEGF下调能够促进mi R-96诱导的MC3T3-E1细胞成骨分化;而将agomir-96与HBEGF表达载体共转染至MC3T3-E1细胞并成骨诱导后,HBEGF表达载体导致的HBEGF表达上调则抑制mi R-96诱导的MC3T3-E1细胞成骨分化。上述结果进一步表明mi R-96通过抑制HBEGF表达来介导成骨细胞的分化。四、结论1.本研究通过在线设计软件Zinc Finger Tools设计了以Osx启动子为靶点的人工转录因子ZFP2-VP64。ZFP2-VP64能够特异性结合到Osx启动子的-387/-370位点,并能显著激活Osx基因的转录。ZFP2-VP64导致的Osx表达上调能够促进成骨细胞与骨髓间充质干细胞的成骨分化,并能减少卵巢摘除术小鼠股骨局部骨量丢失。这些结果表明,ZFP2-VP64具有进一步开发为治疗骨质疏松药物的可能性,值得进一步研究。2.本研究通过生物信息学预测,并经卵巢摘除术小鼠股骨组织、成骨细胞及分子水平多种方法检测,鉴定出mi R-96为成骨分化过程中起正性调节作用的mi RNA分子。HBEGF,而非Osx,为miR-96的分子靶标。miR-96通过抑制HBEGF-EGFR通路起到促进成骨细胞分化的作用。