论文部分内容阅读
作为水生动物常见病原菌，假单胞菌以其低温致病的特性加大了其预防难度，对水产养殖病害防控提出了新的挑战。本文对大黄鱼内脏白点病的病原杀香鱼假单胞菌胞外蛋白进行鉴定，以期从中筛选出受温度调控的毒力因子，为开展杀香鱼假单胞菌致病机理研究及预防提供基础。 在低温环境使用蛋白超滤浓缩管，制备出保留活性的杀香鱼假单胞菌胞外蛋白样品，经SDS-PAGE电泳，采用改进染色方案，结果显示在实验室中不同培养温度下该菌分泌到胞外的蛋白样品存在可鉴别的差异性，且部分蛋白条带仅在较低温度时发现。利用LC-MS/MS将胞外蛋白混合样品不经分离，直接进行酶解及质谱鉴定，初步鉴定出Hcp、Hcp1、PcrV、ExoU、SseC、SopD与YopD等毒力因子。杀香鱼假单胞菌的胞外蛋白样品经24cm pH3-10的IPG预制胶条进行双向电泳分离，获得了杀香鱼假单胞菌胞外蛋白在20℃和30℃下的2-DE图谱。对2-DE图谱的差异蛋白点进行筛选，选取鉴定了21蛋白点，鉴定发现其中3个点是该菌毒力因子Hcp与Hcp1，且在温度差异影响下存在显著的蛋白水平表达差异。其他毒力因子在选取的21个蛋白点质谱中均未检出。 根据杀香鱼假单胞菌全基因组序列设计引物对其毒力基因的mRNA表达水平进行了荧光定量PCR检测。检测结果显示，杀香鱼假单胞菌Hcp、Hcp1、PcrV、ExoU、SseC、SopD与YopD各毒力因子在mRNA水平上存在显著的表达差异。温度恒定培养条件下，20℃样品各候选毒力因子表达水平普遍高于30℃样品。温度变化刺激下，代表性毒力因子Hcp基因的表达水平对温度变化敏感，响应低温诱导表达。设计引物克隆获得杀香鱼假单胞菌各毒力基因全长，对克隆获得的各毒力基因进行原核表达。成功构建了表达载体并培育出各毒力因子能稳定表达的菌株。经验证，构建的表达载体阅读框正确，可稳定表达各毒力基因，表达的蛋白产物以包涵体形式存在于表达菌株胞内，可用水煮裂解法提取。 本研究对杀香鱼假单胞菌的胞外蛋白主要毒力因子进行了鉴定及表达变化分析，筛选出了受低温诱导表达的胞外毒力因子，为开展其致病机理研究及有效防控该病的发生提供了实验依据和理论基础。