MMSET(multiple myeloma SET protein)也称为NSD2(Nuclear receptor-binding SET domain-protein2),或者WHSC1(Wolf-Hirschhorn Syndrome candidate1),属于组蛋白赖氨酸甲基转移酶家属成员,主要功能为甲基化修饰组蛋白,影响基因转录。MMSET基因编码三种MMSET异构体,异构体Ⅰ包含647个氨基酸,异构体Ⅱ包含1365个氨基酸,可进一步剪切,异构体Ⅲ包含584个氨基酸,也称为RE-ⅡB (IL-5response element Ⅱ-binding protein);三种蛋白异构体均含有多种共同保守结构域,包括PWWP结构域、HMG结构域、PHD锌指结构域和C末端的SET结构域,其酶活性主要由SET结构域决定,SET结构域由最早发现的表达这个结构域的3个酵母基团组成,分别为Su(var)3-9, Enhancer of zeste(E(z))和trithorax(trx)。MMSET其SET结构域在影响基因转录过程中发挥重要作用。除了影响基因转录外,MMSET还参与DNA损伤反应,其作用机制为连接cH2AX-MDC1-NSD2通路,使缠绕在断裂双链DNA上的H4K20甲基化,从而使53BP1特异性聚集于DNA损伤位点,从而导致DNA损伤。MMSET基因位点位于4号染色体短臂远端,在早期生长发育过程中发挥重要作用,4号染色体短臂远端缺失可引起Wolf-Hirschhorn综合征,临床表现为新生儿心脏、骨骼、生殖、泌尿和免疫等多系统发育障碍。在15%多发性骨髓瘤(MM)患者中发现4号染色体易位t(4：14)(p16：q32),引起MMSET基因的过度表达。MMSET的过度表达不仅与多发性骨髓瘤细胞的粘附力、细胞增殖及多发性骨髓瘤的形成密切相关,而且与MM患者的不良预后相关。Li等人使用蛋白质组学方法研究脑肿瘤时发现,与正常脑皮质相比,胶质母细胞瘤MMSET mRNA和蛋白表达异常,当肿瘤增殖时MMSET表达水平明显增高,而沉默MMSET基因表达可以抑制胶质母细胞瘤的进展,提示MMSET可能与胶质母细胞瘤的发生发展密切相关。与正常组织相比,许多肿瘤MMSET mRNA均高表达,包括肺腺癌、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、头颈部肿瘤、膀胱癌、原发性结肠癌、食道腺癌、乳腺癌、急性T淋巴细胞白血病、急性B淋巴细胞白血病、淋巴瘤、黑素瘤、郁积型多发性骨髓瘤、前列腺癌、卵黄囊瘤、卵巢癌、肾透明细胞癌等。MMSET在肺癌组织中表达情况及临床意义尚未系统深入研究,文献仅报道MMSET mRNA在肺腺癌及小细胞肺癌中高表达,本论文使用组织芯片技术及免疫组化技术相结合的方法检测MMSET在肺癌组织中的表达情况,探讨MMSET作为肺癌新的生物标记物的可行性。目的：应用组织芯片技术及免疫组织化学方法检测MMSET在小细胞肺癌、非小细胞肺癌及良性病变肺组织中的表达,探讨MMSET在肺癌发生、发展、浸润、转移中所起的作用,为临床病理诊断、预后估计提供一定的理论依据。方法：1.病例和标本1)实验组收集南方医科大学珠江医院病理科2008年1月至2011年6月手术切除的肺癌石蜡包埋标本,其中小细胞肺癌63例,非小细胞肺癌62例。患者术前均未行放疗和化疗。按照世界卫生组织(WHO)肺及胸膜肿瘤组织学类型修订方案,并参考《外科病理诊断学》对全部资料进行统一的命名和分类。原发性肺癌包括小细胞肺癌63例,肺腺癌31例,肺鳞癌31例,男性90例,女性35例,年龄35-75岁,平均年龄60.4±9.5岁；按肉眼类型：周围型70例,中央型55例；按组织学分级：高分化30例,中分化,21例,低分化40例,未分化34例；按临床分期：Ⅰ期44例,Ⅱ期36例,Ⅲ期35例,Ⅳ期10例；有淋巴结转移转者80例,无淋巴结转移者45例。良性病变肺组织和原发肺癌每例取1点,共计136点。2)对照组取同期良性病变肺组织11例,包括3例手术切除炎性假瘤病例的良性病变肺组织和8例肺大泡的良性病变肺组织。2.组织芯片的制作1)受体蜡块的制作：将德国莱卡蜡和美国进口蜡块按49：1的比例混合经三次沉淀除去杂质后,制成蜡块；2)HE切片上作标记：由导师带领,复查所有HE切片,良性病变肺组织和复原肺癌每例取两点,用记号笔做标记；3)供体蜡块上的相应部位作标记：找到蜡块上的相应点,用记号笔做好标记；4)按照预先设计好的阵列图,用组织阵列仪在受体蜡块上的确定部位钻孔(直径0.6mm,间距1mm,深度大约为2mm),然后从供体蜡块标记处钻取组织芯,小心推入受体蜡块上钻好的孔中,如此将所有的组织芯依次钻取出来,推入受体蜡块相应位置的孔中,制成组织芯片蜡块；5)将芯片蜡块有组织的一面倒放在干净的载玻片上,放入37℃恒温箱中,15min后取出,用载波片轻压蜡块,使芯片蜡块有组织的一面保持平整。6)在准备切片前,先将蜡块在50℃下过夜,进一步使组织芯和受体蜡块融合,自然恢复室温后,4℃过夜；7)3-4μm切片,捞片水温控制在45℃左右,尽量保持片子捞正8)捞片后立即将切片置于58℃下过夜,以备后期实验。3.免疫组化SP法：1)将组织芯片泡在二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)各20min；2)然后将组织芯片泡在100%酒精(Ⅰ)100酒精(Ⅱ)各10min；3)最后将组织芯片泡在95%酒精、90%酒精、85%酒精、80%酒精各10min→水洗；4)使用0.1%枸橼酸缓冲液(pH6.0～6.2)中微波修复抗原,微波温度保持在90℃以上,15-20min后取出后自然恢复室温,PBS洗5min×3次5)每张切片滴加0.3H202去离子水,避光室温放置15～20min→PBS洗5min×3次；6)然后再滴加30%山羊血清,室温放置20min；7)倾去血清,不洗,加Ⅰ抗体,然后在37℃恒温箱孵育50min,自然恢复室温后,4℃冰箱过夜；8)从冰箱取出,恢复室温,PBS洗5min×3次；9)加Ⅱ抗,然后37℃恒温箱孵育60min,再用PBS洗5min×3次；10)加Ⅲ抗37℃恒温箱孵育30min,PBS洗5min×3次；11)DAB显色(DAB溶液；加20滴蒸馏水,加DAB、H202及buffer各—滴,即用即备)；12)Harris苏木染色1～2min→水洗→盐酸酒精分化30s→水洗→淡氨水返蓝→充分水洗13)用80%酒精、85%酒精、90%酒精、95%酒精、100%酒精(Ⅰ)、100%酒精(Ⅱ)浸泡各10min；14)再用二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)浸泡各20min.15)中性树胶封片。4.免疫组织化学着色结果判断MMSET阳性表达定位于细胞核。对组织芯片中各点评分,根据细胞染色强度和染色细胞所占面积两者积分之和来判断。染色强度定性积分为：不着色为0,轻着色为1,中度着色为2,强着色为3；染色面积定量积分：无着色为0,<25%为1,25%～50%为2,>50%为3。两种积分相加为该点得分,对组织芯片来自同一病例的各点的得分相加取平均值,依照0为一,1-2为+,3-4为++,5-6为+++,进行半定量判断：>2(+和++和+++)为阳性,≤2(—)为阴性进行定性判断。结果：1MMSET在良性病变肺组织中表达阴性(0/11),在肺癌组织中总体表达阳性率为46.4%(58/125)；MMSET在小细胞肺癌阳性表达多为阳性和强阳性,而在肺鳞癌和肺腺癌中阳性表达为弱阳性。小细胞肺癌、肺鳞癌、肺腺癌MMSET表达组间总体比较差异有统计学意义(χ2=78.562,P=0.000)；组间两两比较,小细胞肺癌分别与肺鳞癌和肺腺癌比较,差异均有统计学意义(χ2=50.327,P<0.001；χ2=58.236,P<0.001)；而肺鳞癌与肺腺癌比较,差异无统计学意义(χ2=1.069,P=0.612)2MMSET在SCLC与NSCLC组间表达差别有统计学意义(P<0.05),MMSET的表达在低分化组与高分化组,Ⅲ+Ⅳ期和Ⅰ+Ⅱ期,有淋巴结转移组和无淋巴结转移组间的表达差别有统计学意义(P<0.05)。MMSET的表达与患者的年龄、性别、肉眼类型没有重要关联。结论：1MMSET在良性病变肺组织中表达阴性,而在肺癌组织中表达阳性,特别是在小细胞肺癌中表达强阳性,提示MMSET基因是一种肺癌基因,MMSET高表达与肺癌的发生发展相关,在肺癌的发生的早期阶段起重要作用,MMSET有望成为肺癌治疗的新靶点。2MMSET在SCLC中的表达明显高于其在NSCLC中的表达,提示MMSET可以作为鉴另(?)SCLC和NSCLC的指标,同时也提示SCLC和NSCLC的发生发展机制不同。3MMSET的表达与原发性肺癌的分化程度、临床分期和有无淋巴结转移相关,提示MMSET高表达可能促进肿瘤细胞的恶性转化和肿瘤的浸润、转移,MMSET可以作为预后估计的参考指标。4.组织芯片具有高通量、高效率、节省试剂盒时间等优点,并且使各组织的实验条件相同,减少了实验误差,在大样本研究中具有明显的优势。