迷迭香酸(Rosmarinic acid, RA)在植物中分布广泛,主要存在于唇形科和紫草科植物中,具有抗炎、抗菌、抗氧化等生理活性。对植物中迷迭香酸次生代谢途径研究表明,该代谢途径包括分别以苯丙氨酸和酪氨酸为前体的两条平行支路,各经过几步酶促反应生成4-香豆酰-Co-A和3,4-二羟基苯乳酸,二者在迷迭香酸合成酶(Rosmarinic acid synthase, RAS)的作用下生成迷迭香酸。丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为历代常用中药,根和根茎入药。从20世纪90年代以来,以迷迭香酸和丹参酚酸B为代表的水溶性活性成分成为研究的热点。然而迄今关于丹参中迷迭香酸次生代谢途径报道较少,使研究丹参迷迭香酸的次生代谢途径及调控和生物工程改良丹参种质资源存在瓶颈。本研究采用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends, RACE)和基因组步移(Genomic DNA walking)技术,首次从丹参植物中克隆得到迷迭香酸次生代谢途径酪氨酸支路上的三个相关基因:酪氨酸氨基转移酶基因(Tyrosine aminotransferase gene, SmTAT)、对羟基苯丙酮酸还原酶基因(4-hydroxyphenylpylpyruvate reductase gene, SmHPPR)和对羟基苯丙酮酸双氧化酶基因(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase gene, SmHPPD)的全长cDNA序列和基因组DNA序列。对各基因的研究如下:1、SmTAT基因:根据其它物种中的TAT的基因序列,选择保守区域设计特异性引物克隆出丹参的SmTAT的cDNA全长序列及基因组DNA序列。cDNA序列全长1603 bp,包含一个完整的1233 bp的开放阅读框(Open reading frame, ORF),编码411个氨基酸残基。根据蛋白比对的结果,SmTAT基因编码的氨基酸序列与其它物种中报道的已知TAT蛋白序列具有高度的同源性。SmTAT基因组序列包含6个外显子和5个内含子,其启动子和终止子包含多个基因调控元件。该基因在丹参中为组成性表达,且茎中的表达比叶和根高。内源性植物激素信号分子及外界刺激,如甲基茉莉酸(Methyl jasmonic acid, MeJA)、脱落酸(Abscisic acid, ABA)、水杨酸(Salicylic acid, SA)和紫外照射(Ultraviolet-B radiation, UV-B)处理分别在一定程度上上调SmTAT转录水平的表达。2、SmHPPR基因:对羟基苯丙酮酸还原酶(4-hydroxyphenylpylpyruvatereductase, HPPR)是迷迭香酸生物合成途径的第一个特异的关键酶。SmHPPR基因cDNA序列全长1066 bp,包含一个长度为939 bp,编码313个氨基酸残基的ORF。基因组DNA揭示含有2个外显子和1个内含子。SmHPPR基因编码的蛋白含有右旋-2-羟酸脱氢酶家族蛋白的两个典型结构域,与彩叶草中HPPR蛋白的一级、二级和三级结构均具有很高的相似性。SmHPPR启动子和终止子分析,含有多个基因调控元件。该基因在丹参根茎叶器官中为组成性表达,茎中最强,根次之,叶相对较弱。各种刺激考察显示MeJA, SA, ABA和赤霉素(Gibberellic acid, GA3)能上调SmHPPR转录表达水平,UV-B和双氧水(Hydrogen peroxide, H2O2)处理能下调其转录表达水平,提示该基因亦可能受茉莉酸、脱落酸、水杨酸及活性氧族信号调控途径的影响。3、SmHPPD基因:对羟基苯丙酮酸双氧化酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, HPPD)与HPPR共有相同的催化底物,为迷迭香酸生物合成途径的一个旁路位点进入酶,催化对羟基苯丙酮酸转化成尿黑酸,最终形成植物光合作用中电子传递所必需的质体醌和生育酚。根据其它物种中HPPD的基因序列,首次从丹参中克隆得到HPPD的cDNA全长序列及基因组DNA序列。cDNA序列全长1736 bp,包含一个完整的1443 bp的ORF,编码481个氨基酸残基。根据蛋白比对的结果,SmHPPD基因编码的氨基酸序列与其它物种中报道的已知HPPD蛋白序列具有高度的同源性。SmHPPD基因组序列包含2个外显子和1个内含子,其启动子和终止子包含多个基因调控元件。该基因在丹参中为组成性表达,且根和叶比茎中的表达高。UV-B、暗处理与自然光对照,结果显示,UV-B可抑制SmHPPD的转录表达。酪氨酸支路三个代谢基因的克隆与调控分析,为进一步明确阐述丹参中迷迭香酸的生物合成途径打下了坚实的基础,对通过基因工程技术提高药用植物丹参中水溶性酚酸类活性成分的含量,改善丹参的种质资源等具有潜在的重要意义。