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二色补血草是一种盐生开花植物,能够在盐碱化土地上正常生长,其优良的耐盐碱特性使之成为研究植物耐盐机理的理想材料。本研究结合表达序列标签（EST）技术和cDNA微阵列技术在转录水平上研究二色补血草耐盐碱机理,并对从文库中获得的液泡膜H+-ATPase c亚基基因进行了生物信息学分析、表达模式分析及功能验证。以400 mmol/L NaHCO3胁迫处理48h的二色补血草叶片为材料构建了cDNA文库,文库的初始滴度为9.6×105 pfu/ml,文库的重组率为95%,PCR检测插入片段的平均长度为0.9 kb。从cDNA文库中随机挑选2880个克隆进行序列测定,共筛选到2358个高质量的EST序列,建立了二色补血草EST数据库,它们GenBank的登录号为EH792855-EH795212;通过BlastX分析,共有1418条序列与已知基因序列高度同源,将这些EST序列根据MIPS分类标准分为12类,其中代谢、光合作用、功能未知、细胞防御及转运相关四类基因的表达丰度最高,分别占已分类EST总数的18.48%、14.6%、11.99%、11%和10.01%。EST分析表明,有245个EST是与早期逆境响应同源的基因,其中最显著的是金属硫蛋白（EH793637）和脂质转运蛋白（EH794695）,它们各自都占总EST的1.4%。选择1330条EST制作cDNA微阵列,获得了NaHCO3胁迫6h、24h和48h的二色补血草的转录表达谱,筛选到142条差异调节的转录本,6、24和48 h分别有108、43和46个基因出现明显的差异表达。基因芯片研究结果表明,有76%的基因确定是在胁迫早期（胁迫6h）差异表达,因此认为二色补血草在盐碱胁迫初始阶段的响应是重要的。对从二色补血草cDNA文库中获得的液泡膜H+-ATPase c亚基（VHA-c）基因进行了生物信息学分析,VHA-c基因cDNA全长729bp,其中开放读码框（ORF）为498bp,编码165个氨基酸,预测蛋白的分子量为16.6kD,理论等电点为8.62。利用实时荧光定量RT-PCR技术对该基因在二色补血草中的表达模式进行了分析,结果表明,NaCl诱导了VHA-c基因在二色补血草叶部的表达,抑制其在根部的表达;NaHCO3胁迫下,VHA-c基因分别于12h和6h时在叶部及根部表达量最高;Na2CO3胁迫6h时VHA-c基因在根部的表达量最大,48h在叶部大量表达。说明VHA-c基因能够对盐胁迫做出应答,确定该基因为耐盐相关基因。将该基因构建到植物表达载体pROKⅡ上,利用农杆菌介导法实现VHA-c基因对模式植物烟草的转化,通过耐盐性试验,对VHA-c基因进行功能验证。试验结果表明,盐胁迫后,转基因烟草的SOD和POD活性较非转基因烟草显著增加,MDA含量低于非转基因烟草,说明VHA-c基因的表达增强了植物清除活性氧的能力,并降低了植物的膜脂氧化程度,一定程度的提高了转基因烟草的耐盐能力,证实了来源于二色补血草的VHA-c基因具有提高植物耐受盐胁迫之能力的功能。植物的耐盐过程是一个复杂的多基因协同作用的体系。我们通过EST技术和cDNA芯片技术等基因组学研究手段,获得了盐胁迫下二色补血草的基因表达信息,为系统阐明二色补血草抗盐碱分子机理奠定坚实的基础,为进一步分析二色补血草的抗逆机理提供了数据;利用基因工程手段使外源VHA-c基因在烟草中组成型表达,不同程度提高转基因烟草对盐胁迫的耐受能力,为将VHA-c基因利用于林木耐性分子育种提供了重要的前提基础。