【摘 要】
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目的:以抑制性差减杂交技术分离、克隆白血病相关的K562和K562/DOX细胞株之间差异表达相关基因。方法:应用抑制性差减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)技术
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目的:以抑制性差减杂交技术分离、克隆白血病相关的K562和K562/DOX细胞株之间差异表达相关基因。方法:应用抑制性差减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)技术分离白血病细胞株K562与耐药细胞株K562/DOX中差异表达的基因。从K562与K562/DOX中分别提取总RNA,反转录成cDNA,将其分成测试组(K562/DOX)与对照组(K562),分别经同一种限制性内切酶RsaI消化后,K562/DOX细胞株的cDNA分成两组,分别与adopter1和adopter2R两种不同的接头连接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次PCR反应。将产物纯化后与pMD19-T Vector载体连接,并转入大肠杆菌中构建cDNA差减文库,随机挑选单克隆进行PCR扩增验证,并挑取阳性克隆提取质粒并进行测序及同源序列分析,确定分离出的相关差异表达基因。结果:获得差异cDNA片段,克隆后挑取24个单克隆菌落进行PCR鉴定,15个有插入片段,筛选出220个差异基因,测序后进行Blast序列比对分析确定这些片段是差减出的差异基因的片段。发现在220个差异基因中有血红蛋白、核糖体和线粒体等相关基因。其中热休克因子结合蛋白是小热休克蛋白Ⅰ类亚家族成员HSPB1,目前与肿瘤关系尚未见报。结论:用抑制性差减杂交方法及T/A克隆技术成功构建了耐药细胞株K562/DOX与K562细胞株差异表达基因的差减cDNA文库,该差减文库的建立,为进一步筛选、克隆白血病多药耐药细胞株差异表达的新基因奠定了基础
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