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第一部分Twist基因的shRNA干扰表达载体的构建和稳定转染宫颈癌细胞株的建立目的:通过构建Twist基因的pRNAT-U6.1/Neo/shRNA真核表达载体，建立稳定低表达Twist基因的宫颈癌Caski细胞株，为探讨Twist基因影响宫颈癌对紫杉醇的耐药性及其机制的研究提供实验依据。方法:1.针对Twist基因构建4组真核表达载体，并对重组载体进行酶切鉴定和测序。2.经Lipofectamine2000脂质体将pRNAT-U6.1/Neo-Twist-shRNA重组质粒稳定转染至人宫颈癌Caski细胞中，G418筛选，通过荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表达情况，确定转染成功。3.扩大培养，从而建立稳定细胞株Caski-Twist-shRNA。4.应用RT-PCR方法检测稳定细胞株Caski-Twist-shRNA中Twist mRNA的表达情况，鉴定干扰效果并筛选出转染效率最佳的shRNA。结果:1.经双酶切图及测序检测，成功构建重组载体pRNAT-U6.1/Neo-Twist-shRNA。2.重组载体经脂质体Lipofectamine2000稳定转染Caski细胞，荧光显微镜显示获得稳定单克隆细胞株Caski-Twist-shRNA。3. RT-PCR方法鉴定其干扰效果，以Twist扩增产物（489bp）与内参照β-actin（600bp）的比值来表示Twist mRNA的变化，空白对照组和阴性对照组比较差异无显著性（P>0.05），转染组1、转染组2、转染组3、转染组4均与空白对照组和阴性对照组比较差异有显著性（P<0.05），表明成功建立稳定干扰Twist基因表达的Caski-Twist-shRNA细胞系。转染组2与转染组1、转染组3、转染组4比较差异有显著性（P<0.05），表明转染组2的转染效率最佳。后续实验应用转染组2进行实验。结论：1.成功构建重组质粒pRNAT-U6.1/Neo-Twist-shRNA。2.成功建立稳定低表达Twist基因的Caski-Twist-shRNA细胞株。第二部分Twist基因下调对Caski细胞株化疗敏感性改变的机制研究目的：探讨Twist基因下调对Caski细胞株化疗敏感性改变的机制研究。方法：1. MTT实验分为三组：空白对照组（即未转染组，Caski）、阴性对照组（即转染NC组，Caski-shRNA-NC）和实验组（Caski-Twist-shRNA2）。经不同浓度（0.25、0.5、1、2、4μmol/L）紫杉醇处理48小时后，用MTT比色法检测各组细胞的OD值，并计算IC50值，筛选出紫杉醇最佳抑制浓度。2. Western-blot实验分为四组：空白对照组（Caski）、正常对照组（Caski+Taxol）、阴性对照组（Caski-shRNA-NC+Taxol）和实验组（Caski-Twist-shRNA2+Taxol）。经Western-blot检测四组细胞中PI3K和AKT蛋白表达，分析下调Twist基因联合紫杉醇处理后的Caski细胞中PI3K和AKT的蛋白表达。结果：1. MTT结果显示：Twist基因表达下调的细胞（实验组）在不同紫杉醇浓度下的增殖抑制率与空白对照组、阴性对照组相比均显著增加（P﹤0.05），实验组IC50与空白对照组、阴性对照组相比明显降低（P﹤0.05），紫杉醇最佳浓度为1000μmol/L。2. Western-blot结果显示：实验组中PI3K的蛋白表达较阴性对照组、正常对照组和空白对照组均明显降低（P均<0.05），实验组中AKT的蛋白表达较阴性对照组、正常对照组和空白对照组均明显降低（P均<0.05），而阴性对照组和正常对照组中PI3K和AKT的表达无明显差异（P>0.05）。结论：下调Twist基因表达可致PI3K/AKT信号通路蛋白的下调，并增强宫颈癌对紫杉醇的敏感性。