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背景和目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)仍然是终末期肾功能衰竭(end-stage renal failure,ESRF)的主要病因之一,关于DN的发病机制及其治疗的研究一直是学者们密切关注的焦点。近年来众多证据表明,巨噬细胞肾脏内浸润和激活,引发相关炎症因子释放,如促炎因子水平的增加和NF-κB活化,加速了DN发展,但对糖尿病肾组织巨噬细胞激活的信号转导通路尚待阐明。Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)是先天免疫系统中一个经典的膜受体家族,研究证实其家族成员TLR2和TLR4受体可以和糖尿病状态下的病理产物结合,启动自身下游信号通路,并募集激活巨噬细胞,开启一系列的炎症反应,持续加重糖尿病患者的肾脏损伤。近年来中药治疗在DN中受到持续关注,芍药苷(Paeoniflorin,PF),白芍总苷的活性成分,其药理作用可能与抗炎、抗氧化与免疫活性调节有关。本研究中采用PF作用于链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病模型和高糖刺激的小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDMs),从整体,细胞,分子水平观察TLR2/4信号通路和促炎症因子的变化,探讨TLR2/4信号通路参与DN发生的作用机制及PF的干预作用,为DN防治提供新思路。方法:第一部分:取TLR2/4基因敲除小鼠(TLR2/4-/-)及C57BL/6J同窝野生型小鼠骨髓细胞诱导培养为巨噬细胞。CCK-8方法检测PF干预及高糖刺激对BMDMs活力的影响。在不同浓度葡萄糖,不同浓度PF,不同时间点观察TLR2,TLR4,诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)蛋白表达的变化,从而优化实验条件。BMDMs分组:正常对照组(LG),正常对照+PF组(LG+PF),高糖组(HG),高糖+PF组(HG+PF),TLR2-/-对照组(TLR2-/-),TLR2-/-对照+高糖组(TLR2-/-+HG),TLR2-/-对照+高糖+PF组(TLR2-/-+HG+PF),TLR4-/-对照组(TLR4-/-),TLR4-/-对照+高糖组(TLR4-/-+HG),TLR4-/-对照+高糖+PF组(TLR4-/-+HG+PF)。于刺激的相应时间点收集细胞,另收集细胞培养上清,离心后供ELISA检测。观察高糖刺激下PF干预,TLR2/4基因敲除对BMDMs趋化功能的影响;流式细胞技术检测BMDMs在高糖诱导下的极化分型;实时荧光定量PCR法(Quantitative Real-time PCR)测定各分组细胞中IL-1β,TNF-α,MCP-1及i NOS m RNA的转录表达;Western blot检测各组总蛋白中TLR2,TLR4,My D88,Trif,p-IRAK-1,p-IRF3,IRF3,NF-κB p65,NF-κB p-p65,i NOS蛋白的表达;ELISA试剂盒检测各组细胞上清液中促炎症因子TNF-α,IL-1β,MCP-1的分泌情况。第二部分:健康雄性TLR2/4基因敲除(TLR2/4-/-)及C57BL/6J同窝野生型小鼠腹腔注STZ,50mg/kg,共5天,注射一周后测尾静脉随机血糖,血糖>16.7mmol/L者确定为糖尿病模型。将模型小鼠随机分为糖尿病模型组,PF给药(25,50,100mg/kg.d)组,TLR2-/-糖尿病模型组,TLR4-/-糖尿病模型组,每组各12只;另取健康雄性C57BL/6J同窝野生型小鼠,TLR2/4基因敲除鼠作为正常对照组,每组各12只。于用药后第12周末收集各组小鼠血、尿和肾组织标本,测定血糖、体重、肾重以及24h尿白蛋白排泄率;观察肾组织病理改变;免疫组化检测CD68,TLR2,TLR4及NF-κB p65蛋白表达;western blot检测肾组织TLR2,TLR4,My D88,Trif,p-IRAK-1,p-IRF3,IRF3,NF-κB p65,NF-κB p-p65蛋白的表达;实时定量PCR检测TNF-α,MCP-1,IL-1β及i NOS的m RNA的表达。结果:第一部分:①与对照组相比,实验所需浓度的PF对高糖诱导的BMDMs生长活力无明显影响(P>0.05)。②高糖诱导刺激可以增加MCP-1对巨噬细胞的趋化,PF干预和TLR2/4基因敲除均可以抑制高糖诱导的巨噬细胞迁移(P<0.01)。③流式细胞术结果显示:高糖的刺激可成功使BMDMs向M1功能表型极化;PF干预和TLR2/4基因缺失组细胞阳性标记CD11c百分比明显降低(P<0.01)。④实时荧光定量PCR检测结果显示,与LG组相比,HG组细胞TNF-α,MCP-1,IL-1β及i NOS m RNA的表达明显上调(P<0.01);PF干预组和TLR2/4基因敲除组上述m RNA表达与HG组相比明显下调(P<0.05;P<0.01)。⑤Western blot结果显示,HG组i NOS蛋白及TLR2,TLR4,My D88,Trif,p-IRAK-1,p-IRF3,IRF3,NF-κB p-p65,NF-κB p65信号通路蛋白表达与LG组相比明显增强(P<0.01);PF干预使得上述蛋白表达明显抑制(P<0.05;P<0.01);TLR2基因敲除可使TLR2,My D88,p-IRAK-1,NF-κB p65,NF-κB p-p65,i NOS蛋白表达明显低于HG组(P<0.01);但在TLR2基因敲除组Trif,p-IRF3,IRF3的表达较HG组无明显变化(P>0.05);TLR4基因敲除可使TLR4,My D88,Trif,p-IRAK-1,p-IRF3,IRF3,NF-κB p-p65,NF-κB p65,i NOS蛋白表达明显低于HG组(P<0.01)。⑥Elisa方法检测结果示,HG组细胞培养基中所含TNF-α,IL-1β,MCP-1较LG组增加明显;PF干预组和TLR2/4-/-+HG组巨噬细胞TNF-α,IL-1β,MCP-1的蛋白分泌与HG组相比明显下调(P<0.01)。第二部分:①与对照组相比,12周糖尿病模型组小鼠血糖、肾重/体重及24h尿白蛋白排泄率均明显升高(P<0.05;P<0.01);PF干预治疗及TLR2/4基因敲除可使相应小鼠肾重/体重比值,24h尿白蛋白排泄率较模型组小鼠显著减低,差异具有统计学意义(P<0.05;P<0.01)。②光镜下观察到12周糖尿病模型组肾组织中肾小球体积增大、系膜细胞增多、基底膜增厚以及细胞外基质增多,而PF干预及TLR2/4基因缺失组小鼠肾脏组织中的上述病理改变得到明显改善(P<0.05;P<0.01)。③免疫组化结果显示,模型组TLR2,TLR4,CD68及NF-κB p65表达明显高于对照组(P<0.01);PF干预及TLR2/4基因敲除可使TLR2,TLR4,CD68及NF-κB p65蛋白表达明显降低(P<0.01)。④Western blot结果显示,12周糖尿病模型小鼠较对照组TLR2,TLR4,My D88,Trif,p-IRAK-1,p-IRF3,IRF3,NF-κB p-p65,NF-κB p65蛋白的表达明显上调(P<0.01);PF干预及TLR4基因敲除组与模型组相比上述蛋白的表达明显下降(P<0.01);但TLR2的基因缺失对Trif,p-IRF3,IRF3蛋白表达无影响,与糖尿病模型组小鼠相比差异无统计学意义(P>0.05);⑤实时荧光定量PCR结果显示,与对照组比较,模型组促炎症因子TNF-α,MCP-1,IL-1β及i NOS m RNA表达明显增加(P<0.01);PF干预及TLR2/4基因敲除组与模型组相比,上述指标m RNA表达则明显抑制(P<0.01)。结论:1高糖环境下,BMDMs活化,i NOS高表达,细胞内TLR2/4及下游信号传导通路表达上调,导致促炎症因子表达增加,PF干预及TLR2/4基因敲除抑制上述信号通路激活,下调巨噬细胞炎症因子的表达,同时抑制巨噬细胞的表型变化。2体内实验初步证实,糖尿病状态下TLR2/4在肾组织内表达增强,伴有肾小球系膜细胞增殖、细胞外基质积聚、巨噬细胞浸润活化等肾脏慢性炎症病理改变,提示TLR2/4参与糖尿病肾病的发生。3 STZ诱导糖尿病小鼠肾组织TLR2/4及下游信号通路蛋白的表达上调,促炎症因子和i NOS合成增加,PF干预及TLR2/4基因敲除可以抑制上述蛋白表达。