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背景糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最常见的微血管并发症之一,也是导致终末期肾脏病(end-stage renal disease, ESRD)的重要原因。蛋白尿是DN最常见的临床表现,也是糖尿病肾病进展的独立危险因素,因此减少蛋白尿是糖尿病肾病治疗的重要举措。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分,其结构和功能的改变在DN蛋白尿的发生、发展过程中起到了关键的作用。足细胞参与蛋白尿形成的原因很多,机制复杂。作为一种终末分化的脏层上皮细胞,足细胞在某些刺激物的作用下可通过特定程序向间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT),但足细胞在高糖环境下是否发生上皮-间充质转分化以及足细胞的间充质转分化是否参与蛋白尿的形成尚不清楚。目前研究认为,有三条信号通路介导了足细胞的转分化过程,即TGF-β/smad、integrin/ILK和Wnt/β-catenin,而广泛存在于真核生物体内的糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase3β, GSK-3β)是以上三条通路的参与者,但其是否参与高糖环境下足细胞的转分化目前尚不明确。无机离子锂(本课题使用氯化锂)是一种治疗狂躁和抑郁症的药物,是GSK-3β的选择性活性抑制剂,通过锂的作用,抑制高糖环境下GSK-3β的活性,并观察足细胞表型和功能的变化,或许能为糖尿病肾病蛋白尿寻找新的治疗靶点。目的本实验通过观察高糖环境下小鼠足细胞表型和功能的改变、GSK-3β表达量和活性的改变、以及抑制GSK-3β活性和表达量后足细胞表型和功能的变化,来研究GSK-3β在高糖环境下足细胞转分化效应中的作用,并为糖尿病肾病蛋白尿的治疗寻找新的靶点。方法以条件永生化小鼠足细胞为研究对象。1.高糖环境下检测足细胞表型和功能：(1)不同浓度葡萄糖对足细胞表型的影响：用含不同浓度葡萄糖(12.5、25、50mmol/L)的1640培养基处理足细胞36h,并设正常对照组(5.6mmol/L葡萄糖)和高渗对照组(5.6mmol/L葡萄糖+44.4mmol/L甘露醇),采用Western-blot与间接免疫荧光的方法检测足细胞表面标记蛋白nephrin,podocin和间充质细胞表型标志物α-SMA,Fibronectin的表达；(2)不同浓度葡萄糖刺激足细胞36h后白蛋白流入量的变化：将分化成熟的足细胞以一定密度(5×10~3)接种于transwell小室上层的聚酯纤维膜上,待细胞融合后,换无血清培养基饥饿8小时,然后使用含不同浓度葡萄糖(5.6、12.5、25、50mmol/L)的1640培养基处理足细胞36小时,36h后使用灭菌PBS洗涤细胞两次,然后给Transwell滤过膜的上部换上0.3ml的RPMI1640培养基,下部充满1ml含40mg/ml胎牛血清白蛋白的RPMI1640培养基,于37℃孵育1小时后,取上层培养液,用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定滤过膜上部培养基的白蛋白浓度,即白蛋白流入量。2.高糖环境下足细胞GSK-30表达量及活性的变化：(1)不同浓度葡萄糖(5.6、12.5、25、50mmol/L Glu)处理足细胞36h后,用Western-blot检测GSK-3β及其9位丝氨酸位点pSer9GSK-3β(抑制位点)的表达量以及216位酪氨酸位点pTyr216GSK-3β(活化位点)的表达量；(2)不同糖浓度处理的足细胞GSK-3β活性的变化：足细胞按上述浓度分组培养36h后,按照GSK-3β活性检测试剂盒(Genmed Scientific,美国)说明书处理足细胞,依次加入各种试剂,于分光光度计上检测各组样品的OD值,按试剂盒说明书给出的公式计算GSK-3β的活性。3.应用siRNA干扰GSK-3p后检测足细胞表型及功能：根据Gene Bank数据库提供的小鼠的GSK-3β全长基因(Gene Bank NO.NM-019827.6)由上海吉凯基因化学技术有限公司设计的靶序列mRNA(5’-3’)为：CCACTCAAGAACTGTCAAGTA.,阴性对照的siRNA正义链(5’-3’)序列为：UUCUCCGAACGUGUCACGUtt。应用转染试剂LipofectamineTM2000(invitrogen,美国)将GSK-3βsiRNA以30nmol的浓度转染足细胞36小时后检测各组足细胞nephrin,podocin,a-SMA表达量的变化；同时应用Transwell检测各组的白蛋白流入量以评估足细胞的单层屏障功能。4.应用GSK-30活性抑制剂后足细胞表型及功能的变化应用LiCl,一种经典的GSK-3β活性抑制剂,观察抑制GSK-3p活性后足细胞表型及功能的变化,或许能为糖尿病肾病蛋白尿的临床治疗提供借鉴。将实验分为正常糖对照组(5.6mmol/L Glu),正常糖+LiCl组,高糖组(25mmol/L Glu)、高糖+LiCl组,检测各组足细胞标记蛋白nephrin,podocin,间充质标记蛋白a-SMA,Fibronectin的表达量,并应用Transwell检测各组足细胞的白蛋白流入量,观察单层屏障功能的变化。结果1.(1) Western-blot与间接免疫荧光结果均显示：与高糖组相比,正常糖对照组和高渗对照组足细胞高表达nephrin,podocin,仅少量表达间充质蛋白标记物a-SMA,Fibronectin;对Western-blot结果进行灰度分析,发现nephrin,podocin的蛋白表达水平随葡萄糖浓度的升高呈剂量依赖性下调(p<0.05), a-SMA的表达水平随葡萄糖浓度的升高呈剂量依赖性上调(P＜0.05)；(2)用Transwell测不同处理的足细胞白蛋白流入量,评估足细胞的单层屏障功能,发现与正常糖浓度组相比,高糖组白蛋白流入量增加,且随葡萄糖浓度的升高呈计量依赖性上调(P＜0.05)。2.(1) Western-blot结果显示,与正常糖及高渗对照组相比,高糖组足细胞GSK-3β表达量增多,pSer9GSK-3β表达量减少,pTyr216GSK-3β表达量增多,差异均具有统计学意义(P<0.05);(2) GSK-3β激酶活性检测试剂盒显示,与正常糖相比,经高糖处理的足细胞GSK-3p活性增强,差异有统计学意义(P＜0.05)。3.应用GSK-3βsiRNA处理足细胞发现,应用GSK-3βsiRNA处理组与阴性对照组及高糖对照组相比,足细胞表面标记蛋白nephrin,podocin表达量增多,间充质标记蛋白a-SMA表达减少；用Transwell检测各组白蛋白流入量,发现处理组白蛋白流入量减少,单层屏障功能改善。4.高糖环境下,应用GSK-3β活性抑制剂LiCl可以部分逆转足细胞的转分化,改善足细胞的单层屏障功能。结论1.足细胞在高糖环境下发生转分化(表型改变与功能受损)。2. GSK-3β参与高糖环境下足细胞的转分化。3. GSK-3β抑制剂氯化锂可以一定程度逆转足细胞转分化,改善足细胞单层屏障功能。