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东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）是蜜蜂肠道内专性寄生真菌，在世界范围内分布。西方蜜蜂（Apis mellifera）和东方蜜蜂（A.cerana）均感染普遍，是造成蜜蜂寿命缩短，蜂群衰弱，生产能力下降的重要原因之一。因此，东方蜜蜂微孢子虫的防治研究对蜂业的可持续发展具有十分重要实践意义。
虽然烟曲霉素等药物对东方蜜蜂微孢子虫有抑制效果，但长期使用易对蜜蜂产生毒害，并且在蜂产品中残留。已有研究表明，RNAi具有相对安全，且表现具明显的抑制微孢子虫的效果。因此，本研究选取了微孢子虫的3个基因作为靶标，研究人工饲喂dsRNA对东方蜜蜂微孢子虫干扰的有效性，为安全、有效地防治东方蜜蜂微孢子虫提供参考。
鉴于孢壁蛋白在孢子形态及侵染方面具有重要作用，选取了东方蜜蜂微孢子虫的2个孢壁蛋白（Nc5、Nc8），以及1个核糖体合成相关蛋白基因（Nc23）作为研究对象，对它们的表达时序、饲喂dsRNA和dsRNA表达工程菌的效果进行了研究，具体结果如下：
1.在每只初羽化意大利蜜蜂（A.m.ligustica）工蜂接种5000个孢子的剂量下，用定量PCR技术检测了东方蜜蜂微孢子虫侵染工蜂后两种孢壁蛋白（Nc5、Nc8）和一种核糖体蛋白（Nc23）随着侵染日龄的增加其拷贝数的表达水平。结果表明，在10天内，Nc5、Nc8、Nc23三个基因均在第8d的表达量最高，分别为6.36×106，1.59×107，8.02×106拷贝/蜂。其中，Nc23在4日龄以前表达量高于Nc8基因和Nc5基因；Nc8基因在6日龄以后的表达量高于Nc23基因和Nc5基因；三个基因的绝对表达量在6日龄后出现快速增长。
2.通过试剂盒合成东方蜜蜂微孢子虫Nc5、Nc8、Nc23三个基因以及参照GFP基因的dsRNA。初羽化（＜24h）意大利蜜蜂工蜂在每只蜂接种5000个孢子的剂量下，分别给每只工蜂每天经口饲喂30ng的dsRNA，连续饲喂6天，第7至12天时换成正常蔗糖液（50%，W/V），并于第6、9、12天取中肠，镜检微孢子虫数。结果表明，在第6，9天，饲喂了以上三个目标基因dsRNA蜜蜂中肠的产孢量均极显著低于空白对照组（Nc）和dsRNA对照组ds-GFP（p＜0.0001），其中，核糖体蛋白基因的ds-Nc23的抑制效果较两个孢壁蛋白基因的ds-Nc5和ds-Nc8的抑制效果更显著（p＜0.0001）。12天时，原饲喂三个靶标dsRNA的孢子量仍显著低于空白对照组的孢子量，说明三个基因的dsRNA均能显著降低产孢量。在12天内，各组存活率之间无显著差异（p=0.3531），说明每蜂连续饲喂6天30ng dsRNA对意蜂工蜂的存活率无显著影响（p＞0.05）。
3.将Nc5、Nc8、Nc23三个靶标基因及对照GFP片段克隆到dsRNA表达质粒L4440中，再转化到dsRNA表达菌E.coli HT115中，获得含质粒L4440-Nc23、L4440-Nc5、L4440-Nc8、L4440-GFP的四株dsRNA表达工程菌，经IPTG过夜诱导后，收集菌体，沸水处理5min，杀死菌体，再分别稀释至吸光值（OD）为0.1和0.05浓度后，以1∶1体积比与糖浆混合，饲喂接种了5000个孢子的初羽化工蜂，连续饲喂6天后，比较工蜂中肠微孢子虫Nc5，Nc8，Nc23三个基因的表达量。结果表明，在试验条件下，喂菌组的微孢子虫的表达量或与对照接种组无显著差异（p＞0.05），或比对照组的表达量显著高（p＜0.05）。从结果中可以看出，饲喂0.1OD/2菌液的表达量比0.05OD/2的表达量要低，因此，可能饲菌量偏低，同时dsRNA未能完全释放，导致dsRNA浓度不足以产生抑制效果。
4.从单基因干扰试验中，选取了抑制效果最好的ds-Nc23与已报道的东方蜜蜂微孢子虫能量转运蛋白ADP/ATP基因的dsRNA分别或混合饲喂接种了5000个东方蜜蜂微孢子虫孢子的工蜂，连续饲喂6天，之后6天喂普通糖水。结果表明，在饲喂后的第6天，ds-ADP/ATP、ds-Nc23、ds-Nc23+ADP/ATP三者对产孢量均有显著的抑制效果（p＜0.05），三者之间无显著差异（p＞0.05）；到第9天，仅ds-Nc23+ADP/ATP有显著抑制效果（p＜0.05），而ds-Nc23和ds-ADP/ATP均无显著抑制效果（p＞0.05），显示双靶标较单靶标的抑制效果好。到第12天，ds-ADP/ATP和ds-Nc23+ADP/ATP仍有显著抑制效果，而ds-Nc23无。ds-Nc23+ADP/ATP的抑制效果虽与ds-ADP/ATP无显著差异，但平均孢子量更低，显示双靶标抑制较单靶标有更好的抑制效果。ds-Nc23对孢子产量的抑制效果不如ds-ADP/ATP（p＜0.05）。在12天时，CK、Nc、ds-GFP、ds-ADP/ATP、ds-Nc23、ds-Nc23+ADP/ATP的存活率分别是98.3%、91.3%、86.1%、98.7%、84.9%和94.9%。饲喂双靶标dsRNA后，Nc、ds-Nc23、ds-GFP的存活率比CK、ds-ATP/ADP、ds-ATP/ADP+ds-Nc23的存活率显著低（p＜0.05）。说明，ds-ATP/ADP、ds-ATP/ADP+ds-Nc23的饲喂不会影响工蜂的生存率，而ds-Nc23、ds-GFP的存活率比对照显著下降，尽管存活率都在85%以上，仍对蜂存活有负面影响。对dsRNA饲喂3、9和12天后工蜂apidaecin、hymenoptaecin、abaecin、defensin四个免疫基因的相对表达量与对照组间无显著差异（p＞0.05）；但在饲喂6天后，ds-ADP/ATP+Nc23饲喂组的hymenoptaecin表达量显著低于CK、ds-egfp、ds-ADP/ATP（分别为p=0.0064，p=0.0037，p=0.0242）。
虽然烟曲霉素等药物对东方蜜蜂微孢子虫有抑制效果，但长期使用易对蜜蜂产生毒害，并且在蜂产品中残留。已有研究表明，RNAi具有相对安全，且表现具明显的抑制微孢子虫的效果。因此，本研究选取了微孢子虫的3个基因作为靶标，研究人工饲喂dsRNA对东方蜜蜂微孢子虫干扰的有效性，为安全、有效地防治东方蜜蜂微孢子虫提供参考。
鉴于孢壁蛋白在孢子形态及侵染方面具有重要作用，选取了东方蜜蜂微孢子虫的2个孢壁蛋白（Nc5、Nc8），以及1个核糖体合成相关蛋白基因（Nc23）作为研究对象，对它们的表达时序、饲喂dsRNA和dsRNA表达工程菌的效果进行了研究，具体结果如下：
1.在每只初羽化意大利蜜蜂（A.m.ligustica）工蜂接种5000个孢子的剂量下，用定量PCR技术检测了东方蜜蜂微孢子虫侵染工蜂后两种孢壁蛋白（Nc5、Nc8）和一种核糖体蛋白（Nc23）随着侵染日龄的增加其拷贝数的表达水平。结果表明，在10天内，Nc5、Nc8、Nc23三个基因均在第8d的表达量最高，分别为6.36×106，1.59×107，8.02×106拷贝/蜂。其中，Nc23在4日龄以前表达量高于Nc8基因和Nc5基因；Nc8基因在6日龄以后的表达量高于Nc23基因和Nc5基因；三个基因的绝对表达量在6日龄后出现快速增长。
2.通过试剂盒合成东方蜜蜂微孢子虫Nc5、Nc8、Nc23三个基因以及参照GFP基因的dsRNA。初羽化（＜24h）意大利蜜蜂工蜂在每只蜂接种5000个孢子的剂量下，分别给每只工蜂每天经口饲喂30ng的dsRNA，连续饲喂6天，第7至12天时换成正常蔗糖液（50%，W/V），并于第6、9、12天取中肠，镜检微孢子虫数。结果表明，在第6，9天，饲喂了以上三个目标基因dsRNA蜜蜂中肠的产孢量均极显著低于空白对照组（Nc）和dsRNA对照组ds-GFP（p＜0.0001），其中，核糖体蛋白基因的ds-Nc23的抑制效果较两个孢壁蛋白基因的ds-Nc5和ds-Nc8的抑制效果更显著（p＜0.0001）。12天时，原饲喂三个靶标dsRNA的孢子量仍显著低于空白对照组的孢子量，说明三个基因的dsRNA均能显著降低产孢量。在12天内，各组存活率之间无显著差异（p=0.3531），说明每蜂连续饲喂6天30ng dsRNA对意蜂工蜂的存活率无显著影响（p＞0.05）。
3.将Nc5、Nc8、Nc23三个靶标基因及对照GFP片段克隆到dsRNA表达质粒L4440中，再转化到dsRNA表达菌E.coli HT115中，获得含质粒L4440-Nc23、L4440-Nc5、L4440-Nc8、L4440-GFP的四株dsRNA表达工程菌，经IPTG过夜诱导后，收集菌体，沸水处理5min，杀死菌体，再分别稀释至吸光值（OD）为0.1和0.05浓度后，以1∶1体积比与糖浆混合，饲喂接种了5000个孢子的初羽化工蜂，连续饲喂6天后，比较工蜂中肠微孢子虫Nc5，Nc8，Nc23三个基因的表达量。结果表明，在试验条件下，喂菌组的微孢子虫的表达量或与对照接种组无显著差异（p＞0.05），或比对照组的表达量显著高（p＜0.05）。从结果中可以看出，饲喂0.1OD/2菌液的表达量比0.05OD/2的表达量要低，因此，可能饲菌量偏低，同时dsRNA未能完全释放，导致dsRNA浓度不足以产生抑制效果。
4.从单基因干扰试验中，选取了抑制效果最好的ds-Nc23与已报道的东方蜜蜂微孢子虫能量转运蛋白ADP/ATP基因的dsRNA分别或混合饲喂接种了5000个东方蜜蜂微孢子虫孢子的工蜂，连续饲喂6天，之后6天喂普通糖水。结果表明，在饲喂后的第6天，ds-ADP/ATP、ds-Nc23、ds-Nc23+ADP/ATP三者对产孢量均有显著的抑制效果（p＜0.05），三者之间无显著差异（p＞0.05）；到第9天，仅ds-Nc23+ADP/ATP有显著抑制效果（p＜0.05），而ds-Nc23和ds-ADP/ATP均无显著抑制效果（p＞0.05），显示双靶标较单靶标的抑制效果好。到第12天，ds-ADP/ATP和ds-Nc23+ADP/ATP仍有显著抑制效果，而ds-Nc23无。ds-Nc23+ADP/ATP的抑制效果虽与ds-ADP/ATP无显著差异，但平均孢子量更低，显示双靶标抑制较单靶标有更好的抑制效果。ds-Nc23对孢子产量的抑制效果不如ds-ADP/ATP（p＜0.05）。在12天时，CK、Nc、ds-GFP、ds-ADP/ATP、ds-Nc23、ds-Nc23+ADP/ATP的存活率分别是98.3%、91.3%、86.1%、98.7%、84.9%和94.9%。饲喂双靶标dsRNA后，Nc、ds-Nc23、ds-GFP的存活率比CK、ds-ATP/ADP、ds-ATP/ADP+ds-Nc23的存活率显著低（p＜0.05）。说明，ds-ATP/ADP、ds-ATP/ADP+ds-Nc23的饲喂不会影响工蜂的生存率，而ds-Nc23、ds-GFP的存活率比对照显著下降，尽管存活率都在85%以上，仍对蜂存活有负面影响。对dsRNA饲喂3、9和12天后工蜂apidaecin、hymenoptaecin、abaecin、defensin四个免疫基因的相对表达量与对照组间无显著差异（p＞0.05）；但在饲喂6天后，ds-ADP/ATP+Nc23饲喂组的hymenoptaecin表达量显著低于CK、ds-egfp、ds-ADP/ATP（分别为p=0.0064，p=0.0037，p=0.0242）。