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目的:通过“外湿+内湿+药物”建立病证结合模型,观察疸清颗粒对湿热证肝内胆汁淤积模型大鼠一般情况的影响,对药效学指标(ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL、TBA、胆汁流量及流速、胆汁成分分析、LP-X、肝组织病理改变)变化的影响以及对药物作用机制指标(Na~+-H~+交换体、NTCP、BSEP)表达的影响,探讨疸清颗粒对湿热证肝内胆汁淤积大鼠的疗效及其作用机制。结合临床试验,评价疸清颗粒对肝内胆汁淤积湿热证患者的临床疗效及部分机制。材料与方法:实验部分:1.实验材料:选择健康清洁级Wistar雄性大鼠60只。治疗组采用疸清颗粒,阳性药对照组采用茵栀黄颗粒。2.分组方法:将60只大鼠按体重随机分为6组:空白对照组、模型1组、模型2组、茵栀黄颗粒组、疸清颗粒高剂量组及低剂量组各10只。3.造模方法:外湿+内湿+药物在长夏湿热季节将50只大鼠放于湿热造模箱内,喂饲葡萄糖和猪油脂混合液21天,之后一次性注射ANIT造成急性肝内胆汁淤积。4.药物干预方法:茵栀黄颗粒组及疸清颗粒低剂量组按1.62g/kg灌胃,疸清颗粒高剂量组按6.48g/kg灌胃,空白对照组、模型1组及模型2组均给予生理盐水按10ml/kg灌胃,连续7天,每日1次。5.观察指标5.1大鼠的一般情况5.2药效学指标观测ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL、TBA、胆汁流量及流速、胆汁成分分析、LP-X及肝组织病理改变。5.3药物作用机制指标观测大鼠肝组织中Na~+-H~+交换体、NTCP、BSEP的m RNA表达水平。临床部分:1.分组将已纳入的符合诊断的60例患者随机分为对照组和治疗组各30例。2.治疗方法对照组予谷胱甘肽1.2克静脉滴注,腺苷蛋氨酸1.0克静脉滴注,并口服熊去氧胆酸片,250 mg/次,3次/d。治疗组在对照组静脉滴注用药的基础上,口服疸清颗粒,6g/次,3次/d。3.观测项目3.1患者的一般项目3.2疗效性观测项目(1)填写中医证候量化评分表;(2)血清ALT、ALP、GGT、5’-NT、TBIL、DBIL、TBA及CHOL的检测。3.3机制性观测项目(1)炎症因子检测,包括TNF-α,IL-1及IL-6;(2)氧化应激指标检测,包括SOD和MDA。3.4安全性观测项目结果:实验部分:1.大鼠的一般情况空白对照组的大鼠正常进食进水,活动正常,精神状态良好,体重逐渐增加,尿色淡黄。湿热造模箱内的大鼠于第7天出现毛发无光泽,耳背及尾部皮肤略显黄色,食欲下降,尿液深黄色,大便溏,精神不振,少动,易激惹。ANIT灌胃后半天大鼠出现食欲不振,进食进水量均明显下降,精神萎靡。实验过程中发现疸清颗粒高低剂量组及茵栀黄颗粒组治疗3天后,大鼠的食欲、精神状态开始有所好转,且大鼠的各项状态随治疗时间的延长而好转,但茵栀黄组大鼠多持续稀溏便,而疸清颗粒组大鼠大便可恢复正常。2.对大鼠生化学的影响模型1组、模型2组与其余4组比较,各项肝酶指标均显著升高(P<0.05),并且模型2组升高程度不及模型1组,差异具有统计学意义(P<0.05)。除模型组外的其余4组间比较,无明显差异(P>0.05)。说明疸清颗粒高低剂量组均可以降低肝酶,使其接近空白对照组,疗效与茵栀黄组一致。与空白对照组、疸清颗粒高低剂量组相比,模型1组、模型2组及茵栀黄组TBIL、DBIL、TBA指标均显著升高(P<0.05),但茵栀黄组升高程度不及模型1组和模型2组,差异具有统计学意义(P<0.05),并且模型2组升高程度也不及模型1组,差异也具有统计学意义(P<0.05)。空白对照组、疸清颗粒高剂量组及疸清颗粒低剂量组三组间比较,无明显差异(P>0.05)。说明疸清颗粒高低剂量组可以明显降低大鼠的TBIL、DBIL、TBA指标,使其接近空白对照组,疗效优于茵栀黄组。3.对大鼠胆汁流量、流速及胆汁成分的影响与其余4组比较,模型1组和模型2组的胆汁流量、流速均显著下降(P<0.05),并且两模型组间比较各指标无显著差异(P>0.05),除模型组外的其余4组组间比较,也无显著差异(P>0.05)。说明大鼠通过自身修复,并不能提高胆汁的流量及流速,需早期药物干预。疸清颗粒可以提高肝内胆汁淤积大鼠的胆汁流量及流速,使其接近空白对照组,其疗效与茵栀黄组一致。与其余4组相比,模型1组、模型2组的LEC、TC浓度均显著下降(P<0.05),TBIL、TBA浓度显著升高(P<0.05),并且两模型组组间比较各指标均无显著差异(P>0.05)。除模型组外其余4组组间比较各指标,也无显著差异(P>0.05)。说明大鼠通过自身修复,并不能改善胆汁成分,需早期药物干预。疸清颗粒可以改善肝内胆汁淤积大鼠的胆汁成分,并使其接近空白对照组,疗效与茵栀黄组一致。4.对大鼠LP-X的影响与空白对照组相比,其余5组血清中LP-X有所升高,但茵栀黄组与疸清颗粒高低剂量组升高程度不及模型1组和模型2组,差异具有统计学意义(P<0.05),并且模型2组升高程度也不及模型1组,差异具有统计学意义(P<0.05)。茵栀黄组、疸清颗粒高剂量组及疸清颗粒低剂量组三组间比较,无统计学差异(P>0.05)。说明疸清颗粒可以降低湿热证肝内胆汁淤积大鼠的LP-X含量,但未能接近空白对照组,疗效与茵栀黄组一致。5.对大鼠Na~+-H~+交换体m RNA表达的影响与空白对照组相比,其余5组Na~+-H~+交换体m RNA的表达有所降低,但茵栀黄组与疸清颗粒高低剂量组降低程度不及模型1组和模型2组,差异具有统计学意义(P<0.05),并且模型2组降低程度也不及模型1组,差异具有统计学意义(P<0.05)。疸清颗粒高低剂量组Na~+-H~+交换体的表达又显著高于茵栀黄组(P<0.05),但高低剂量组间无明显差异(P>0.05)。说明疸清颗粒可以提高肝内胆汁淤积大鼠的Na~+-H~+交换体m RNA的表达,但未能接近空白对照组,疗效优于茵栀黄组。6.对大鼠NTCP m RNA表达的影响与空白对照组相比,除疸清颗粒高剂量组外,模型1组、模型2组、茵栀黄组,疸清颗粒低剂量组NTCP m RNA的表达均有所下降,差异显著(P<0.05),但疸清颗粒低剂量组降低程度不及模型1组、模型2组和茵栀黄组,差异具有明显统计学意义(P<0.05),并且模型2组和茵栀黄组降低程度也不及模型1组,差异具有统计学意义(P<0.05)。而模型2组和茵栀黄组比较差异没有统计学意义(P>0.05)。疸清颗粒低剂量组的表达明显低于疸清颗粒高剂量组,差异显著(P<0.05)。说明茵栀黄颗粒对NTCP的表达影响不大,而疸清颗粒不仅可以提高NTCP m RNA的表达含量,且高剂量组可以使其表达接近空白对照组,疗效明显优于低剂量组及茵栀黄组。7.对大鼠BSEP m RNA表达的影响与空白对照组相比,除疸清颗粒高剂量组外,模型1组、模型2组、茵栀黄组,疸清颗粒低剂量组BSEP m RNA的表达均有所下降,差异显著(P<0.05),但茵栀黄组与疸清颗粒低剂量组降低程度不及模型1组和模型2组,差异具有明显统计学意义(P<0.05),并且模型2组降低程度也不及模型1组,差异具有统计学意义(P<0.05),而疸清颗粒低剂量组与茵栀黄组表达程度无明显差异(P>0.05),但他们的表达均低于疸清颗粒高剂量组,差异显著(P<0.05)。说明疸清颗粒不仅可以升高湿热证肝内胆汁淤积大鼠的BSEP m RNA的表达含量,且高剂量组可以使其表达接近空白对照组,疗效明显优于低剂量组和茵栀黄组。8.对大鼠肝组织形态的影响光镜下表现:空白对照组肝细胞呈放射状有序排列,肝小叶结构清晰完整,未见明显病理改变。模型1组及模型2组可见肝细胞肿胀,细胞核变大,并可见脂肪细胞和炎性细胞。茵栀黄颗粒组及疸清颗粒高低剂量组均可见肝细胞组织结构、形态与模型组比较恢复较好,肝细胞水肿减轻,脂肪细胞基本消失,可见小叶间有少量的炎性细胞,肝血窦、中央静脉比较规则、内皮细胞较正常。电镜下表现:空白对照组肝细胞排列整齐,细胞核较大,可见核仁,线粒体呈圆形或长杵状且嵴发达清晰,毛细胆管内有丰富的微绒毛。模型1组及模型2组细胞核边聚且核较大,核内异染色质增多,线粒体肿胀,部分嵴断裂而呈空泡样变,毛细胆管略扩张且管内微绒毛减少。茵栀黄颗粒组及疸清颗粒高低剂量组均可见不同程度的细胞质溶解,细胞器较丰富,细胞核固缩,线粒体收缩。临床部分:1.在提高临床疗效方面,疸清颗粒联合西药治疗与单纯西药治疗疗效一致。2.在中医证候疗效方面,疸清颗粒联合西药治疗明显优于单纯西药治疗。3.在改善中医证候积分方面,疸清颗粒联合西药治疗明显优于单纯西药治疗,尤其在改善部分中医症状方面(胁肋疼痛、口干而苦、脘闷腹胀、皮肤瘙痒、烦躁易怒、小便黄及大便稀溏)疗效更显著。4.在降低肝酶方面,疸清颗粒联合西药治疗与单纯西药治疗疗效一致。5.在降低胆红素、胆汁酸及CHOL方面,疸清颗粒联合西药治疗明显优于单纯西药治疗。6.在减轻炎症反应及氧化应激反应方面,疸清颗粒联合西药治疗明显优于单纯西药治疗。结论:1.疸清颗粒在改善大鼠大便性状及降低TBIL、DBIL、TBA方面,疗效明显优于茵栀黄颗粒。在改善大鼠的一般情况,降低大鼠ALT、AST、ALP,提高胆汁流量及流速、改善胆汁成分及肝组织损害方面与茵栀黄疗效一致。疸清颗粒是通过上调Na~+-H~+交换体、NTCP、BSEP m RNA的表达这一机制来治疗肝内胆汁淤积大鼠,疗效优于茵栀黄颗粒。2.疸清颗粒联合西药治疗在提高中医疗效,改善中医证候及部分中医症状,降低TBIL、TBA及CHOL方面优于单纯西药治疗,两组在疾病疗效及降低ALT、ALP、GGT、5’-NT方面疗效显著但无差异。疸清颗粒可以通过减轻炎症反应及抑制氧化应激这一机制来治疗肝内胆汁淤积患者,疗效优于单纯西药组。