禽流感(Avian influenza,AI)是由禽流感病毒(Avian influenza Virus,AIV)感染多种动物的一种急性高度接触性传染病。NA是禽流感病毒粒子表面的重要抗原,在病毒复制过程中发挥重要作用。近年来,家禽H5N6亚型禽流感疫情不断爆发和人感染H5N6亚型禽流感病例的出现,H5N6亚型禽流感才开始被关注。目前,我国报道的有关N6亚型禽流感病毒有H3N6、H4N6、H5N6和H6N6等。本实验室前期从临床健康鸭中分离出H6N6亚型禽流感病毒,本研究拟在此基础上,开展H6N6亚型禽流感病毒贵州株NA基因的克隆和序列分析、原核表达与多克隆抗体制备以及贵州省N6亚型禽流感血清学调查,以期为贵州省N6亚型禽流感的防控提供基础数据。1.禽流感N6亚型基因克隆及序列分析根据Gen Bank(登录号为KJ484613)禽流感病毒N6基因序列设计特异性引物,对贵州地区分离的H6N6亚型禽流感病毒贵州株进行N6基因的克隆与测序分析,结果显示:4株H6N6亚型禽流感病毒贵州株N6基因的编码区大小均为1380 bp,可编码459个氨基酸,其中从第175-207位缺失33个核苷酸,即编码蛋白颈部存在11个氨基酸缺失(TNSTTTIINN);贵州株N6基因的核苷酸同源性为96.0%~99.1%,其中A/duck/Guizhou/01/2017(H6N6)与A/duck/Guizhou/02/2017(H6N6)为同一分支,A/duck/Guizhou/03/2017(H6N6)和A/duck/Guizhou/04/2017(H6N6)为另一分支;N6亚型毒株与其他非N6亚型毒株明显位于两大分支。2.禽流感N6亚型基因的原核表达与多克隆抗体制备回收H6N6亚型禽流感病毒贵州株A/duck/Guizhou/02/2017的N6基因扩增产物,克隆到原核表达载体PET-32a(+),转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,His-tag镍柱亲和层析纯化N6基因表达蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体,Western-blot检测表达产物的反应原性,结果显示:N6基因表达蛋白主要以包涵体形式存在,蛋白分子量约为70 k Da;表达的重组蛋白能被His抗体和兔源NA抗体所识别。3.贵州省N6亚型禽流感血清学调查以原核表达的N6蛋白为包被抗原,采用ELISA对2016年至2017年收集的813份鸡血清样本进行N6蛋白抗体检测,结果显示:在813份鸡血清样本中有186份为阳性,阳性率为22.88%,其中:2016年N6蛋白抗体阳性率为9.76%(20/205),2017年N6蛋白抗体阳性率为27.30%(166/608),阳性率呈现上升趋势。综上所述,本实验成功对H6N6亚型禽流感病毒贵州株N6基因进行了克隆测序分析、原核表达与多克隆抗体制备和N6亚型抗体检测分析,提示贵州省N6亚型禽流感感染有上升趋势,这对贵州省N6亚型禽流感的预防与控制奠定了科学的基础数据。