实验室早期的工作是运用T7噬菌体展示技术从人肺的cDNA文库中筛选到与晚期糖基化终产物受体(RAGE)胞内段作用的蛋白12种,含有SH2结构域的76 kDa的白细胞蛋白(SLP76)是其中一种。SLP76与RAGE的体内、体外结合实验均证实二者之间存在相互作用。同时我们证实这种相互作用存在刺激依赖性。SLP76是血源性细胞所特有的一种接头蛋白,其在T细胞受体相关信号通路及凝血功能方面起到重要作用,在细胞中SLP76可以和多种蛋白相互作用,并参与多条信号转导通路。SLP76的结构包括氨基末端的SAM结构域、羧基末端的SH2结构域和位于二者之间的富含脯氨酸的结构域及多个磷酸化位点。晚期糖基化终末产物(AGEs)是蛋白质、脂质和核酸等生物大分子在氧化环境里的一种还原糖共价加成物。特别在生物大分子循环代谢速率减慢(如衰老)和一些易造成氧化应激的疾病(如糖尿病、动脉粥样硬化等)过程中生成增多。与其他受体介导AGEs清除不同的是,RAGE与AGEs结合后可激活细胞内多条信号转导通路,进而发挥其病理生理功能。研究表明SLP76或RAGE与不同的配体结合都可以导致核转录因子NF-κB的活化。因此我们可以提出如下假设:当RAGE与其配体相互作用后,RAGE胞内段通过与由SLP76参与的接头蛋白复合体相互作用,再由复合体中的Grb2将信号传递给Ras,Ras可以激活下游的丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶Raf,信号由高度保守的三级激酶模式向下游传递,进而触动细胞内的氧化应激并导致NF-κB的活化,使得效应细胞细胞因子表达谱发生变化,产生相应的生理学和病理学功能。如果上述假设能够得到证实,对阐明RAGE和SLP76相互作用在细胞信号转导过程中的作用具有重要意义,并且能够以RAGE和SLP76相互作用为切入点揭示RAGE相关疾病的发病机制。为此我们构建了一系列SLP76的突变体,对SLP76突变体在整个过程中介导的功能进行丁初步研究。实验分几个阶段进行。第一阶段,制备AGEs。第二阶段,构建十种SLP76突变体。第三阶段,SLP76突变体对MAPK磷酸化的影响。第四阶段,SLP76突变体对自身酪氨酸磷酸化的影响。第五阶段,SLP76突变体对RAGE-SLP76相互作用的影响。综上所述,我们成功制备了具有生物学活性的AGEs;成功构建了十种SLP76突变体,且SLP76各突变体在HEK293细胞中均有稳定表达;免疫共沉淀实验初步确定了SLP76与RAGE相互作用的候选结构域及位点,为SAM结构域,第145为酪氨酸,第173位酪氨酸,第207位丝氨酸;另外我们还明确了共转染野生型RAGE及SLP76的HEK 293细胞在AGEs刺激不同时间点下ERK、p38及JNK的磷酸化状态;明确了在AGEs-RAGE-SLP76通路下,SLP76各突变体对ERK,p38及SLP76自身的酪氨酸磷酸化均无影响。