随着水貂养殖业规模化程度的不断提高,疫病的流行严重妨碍了水貂养殖行业的健康发展,造成了重大的经济损失。水貂肠炎细小病毒(mink enteritis parvoviruses,MEV)是严重危害水貂的主要病原之一,发病率和死亡率较高。在生产实践中,接种水貂肠炎细小病毒疫苗是防控水貂病毒性肠炎的重要措施。但近年来,疫苗免疫失败的例子时有发生,深入了解MEV的分子演化特征对于水貂病毒性肠炎的防控具有重要意义。2015-2016年,本实验室在我国山东省主要水貂养殖地区表现肠炎症状的水貂体内分离到8株细小病毒,命名为MEV-SD1~MEV-SD8,其中MEV-SD7、MEV-SD8 VP2蛋白300位氨基酸为Val,而MEV-SD1~MEV-SD6 VP2蛋白300位氨基酸为Ala,与猫细小病毒(feline parvoviruses,FPV)VP2蛋白300位氨基酸一致。本课题以MEV-SD1、MEV-SD7为研究对象,采用HA/HI、IFA、生长曲线测定、流式细胞术等方法,对MEV-SD1、MEV-SD7的交叉免疫反应、感染效率、增殖以及对细胞的损伤等进行比较研究。结果显示,MEV-SD1和MEV-SD7均能分别与抗MEV-SD1和抗MEV-SD7多抗血清发生血凝抑制反应,且效价高于1:128;MEV-SD7感染的CRFK细胞中绿色荧光强度和病毒滴度均高于MEV-SD1;MEV-SD1和MEV-SD7感染CRFK细胞24 h时对细胞凋亡的诱导作用和细胞周期的阻滞作用不明显,48 h和72 h时MEV-SD7诱导细胞凋亡的比例和细胞周期阻滞在G1期的比例均显著高于MEV-SD1。这表明MEV-SD1和MEV-SD7存在交叉免疫保护,但MEV-SD7的感染效率和复制效率更高,诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期的能力更强。为了从分子水平探究造成这种差异的原因,采用分子病毒学技术,分别构建获得了MEV-SD1和MEV-SD7感染性克隆pM-MEV-SD1、pM-MEV-SD7,并对全基因组进行了序列比较分析。结果显示,MEV-SD1和MEV-SD7全基因组核苷酸同源性为99.0%,与GenBank相关参考毒株的核苷酸同源性为96.2-99.9%;全基因组系统进化分析结果表明,MEV-SD7与分离自中国水貂的MEV-LHV和MEV-L处于同一分支,而MEV-SD1则与20世纪90年代在中国的孟加拉虎(Panthera tigris)中分离到的FPV-G以及在猫中分离到的FPV-HRB-CS1处于同一分支,这进一步表明MEV-SD1属于FPV。MEV-SD1、MEV-SD7 NS1蛋白的氨基酸同源性为99.4%,与其他参考序列同源性为98.5-100%。MEV-SD1和MEV-SD7 VP2蛋白的氨基酸序列同源性为99.5%,与参考序列同源性为97.8-100%。基因组两端发夹结构分析表明,MEV-SD1与MEV-SD7 5?端回文序列完全相同,但与参考株MEV-LHV 5?末端的“U”型回文结构和“bubble”区核苷酸序列存在差异;而MEV-SD1与MEV-SD7 3?端“bubble”结构的序列完全不同,同时MEV-SD1“ear”结构中的“long ear”和“short ear”也发生调换,且序列存在较大差异,另外在NS1蛋白酶切位点附近出现了一个碱基对的替换(T/A-C/G)。VP2 300位氨基酸是细小病毒的重要氨基酸位点,本研究进一步探究了VP2 300位氨基酸突变对MEV-SD1、MEV-SD7生物学特征的影响。基于pM-MEV-SD1和pM-MEV-SD7,采用酶切、连接置换的方法分别对MEV-SD1和MEV-SD7 VP2 300位氨基酸进行A300V、V300A定点突变,获得了MEV-SD1的A300V突变体和MEV-SD7的V300A突变体,分别命名为MEV-SD1 VP2 300V、MEV-SD7 VP2 300A。采用IFA、CCK8检测、生长曲线测定、荧光定量PCR、流式细胞术等方法检测比较突变病毒与亲本病毒的感染效率、对CRFK细胞活性的影响、增殖规律、细胞上清液中病毒滴度、诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞等。结果显示,A300V能够提高MEV-SD1在CRFK细胞中的复制、增殖效率,V300A则降低MEV-SD7在细胞中的复制和增殖效率,这表明VP2300V更有利于水貂肠炎细小病毒在CRFK细胞的增殖。综上所述,两种水貂肠炎细小病毒MEV-SD1和MEV-SD7的生物学特征存在差异,VP2 300位氨基酸的不同是MEV-SD1和MEV-SD7具有不同分子生物学特征的原因之一。MEV-SD1和MEV-SD7 3?末端发夹结构的不同也可能是导致两者生物学特征存在差异的原因,目前尚无报道,其确切生物学意义仍需进一步研究。本课题为深入研究MEV的分子生物学特征奠定了理论基础,也为MEV基因工程苗的研制提供了物质资料。