【摘 要】
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背景肺纤维化是脓毒症相关性ARDS的重要病理过程,以肺成纤维细胞异常增殖活化、大量细胞外基质广泛无序聚集和胶原蛋白沉积为特征。革兰氏阴性杆菌内毒素的成分脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）在脓毒症相关性肺纤维化中发挥重要作用,但LPS引起脓毒症相关性肺纤维化的详细机制未完全阐明。本实验拟通过构建LPS诱导脓毒症相关性肺纤维化的细胞和动物模型,探讨LPS诱导肺成纤维细胞异常代谢过程
【基金项目】
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国家国家自然科学基金面上项目（项目编号:81770060,81870052）； 上海杰出青年医学人才培养资助计划资助（沪卫计人事【2018】16号）；
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背景肺纤维化是脓毒症相关性ARDS的重要病理过程,以肺成纤维细胞异常增殖活化、大量细胞外基质广泛无序聚集和胶原蛋白沉积为特征。革兰氏阴性杆菌内毒素的成分脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）在脓毒症相关性肺纤维化中发挥重要作用,但LPS引起脓毒症相关性肺纤维化的详细机制未完全阐明。本实验拟通过构建LPS诱导脓毒症相关性肺纤维化的细胞和动物模型,探讨LPS诱导肺成纤维细胞异常代谢过程的机制,明确PI3K-Akt-m TOR/PFKFB3通路在此过程中的作用,为该病的早期防治奠定基础。方法1.第一部分:使用LPS刺激人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞系,通过Western blot和免疫荧光技术检测PFKFB3和collagen I蛋白表达情况,细胞能量代谢分析（seahorse）检测细胞耗氧率和产酸率,比色法检测细胞培养上清中乳酸的产生情况。2.第二部分:分别使用有氧酵解的抑制剂2-DG、PFKFB3蛋白的抑制剂3PO和sh RNA慢病毒、m TOR通路的抑制剂雷帕霉素、PI3K-Akt通路的抑制剂Ly294002预处理后再以LPS刺激细胞,通过Western blot技术检测细胞内Akt和m TOR通路蛋白的活化情况、PFKFB3和collagen I蛋白的表达情况,以seahorse检测细胞耗氧率和产酸率,比色法观察乳酸产生情况。通过LPS连续5天腹腔注射构建LPS诱导的小鼠肺纤维化模型,肺组织制作成石蜡切片行HE、Masson和α-SMA免疫组织化学染色,以Western blot检测小鼠肺组织中PFKFB3、α-SMA、collagen I和TGF-β1蛋白表达情况,比色法检测小鼠肺组织中羟脯氨酸含量以及血浆和肺泡灌洗液中乳酸产生情况,并使用PFKFB3抑制剂3PO腹腔注射预处理后按上述方法构建小鼠肺纤维化模型,并观察上述各指标的变化情况。结果1.第一部分:LPS刺激肺成纤维细胞后PFKFB3蛋白表达升高,细胞耗氧率降低、产酸率升高,乳酸产生增加以及I型胶原蛋白合成增加。2.第二部分:予2-DG抑制有氧酵解可逆转LPS诱导的细胞I型胶原蛋白合成;予3PO和sh RNA慢病毒抑制PFKFB3可逆转LPS诱导的细胞有氧酵解和I型胶原蛋白合成;予Ly294002和雷帕霉素分别抑制PI3K-Akt和m TOR通路可逆转LPS诱导的细胞PFKFB3表达增加、有氧酵解增强和I型胶原蛋白合成增加。动物实验证实LPS连续腹腔注射小鼠可以引起小鼠肺纤维化的发生,而预先腹腔内注射3PO抑制PFKFB3后可逆转LPS诱导的小鼠肺组织有氧酵解和肺纤维化的发生。结论LPS能够促进肺成纤维细胞有氧酵解并引起肺纤维化,PI3K-Aktm TOR/PFKFB3通路的活化介导LPS诱导的肺成纤维细胞有氧酵解和I型胶原蛋白的合成从而促进肺纤维化的发生。
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