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肿瘤细胞对不同的化学相关或不相关的抗肿瘤药物产生不敏感性,即多药耐药(Multidrug resistance,MDR)。MDR是造成肿瘤化疗失败的主要原因,产生MDR的原因通常是因为药物失活或被外排泵排出肿瘤细胞。MDR产生的主要分子机制是细胞表面存在一种叫做P-糖蛋白(P-glycoprotein,Pgp)的跨膜糖蛋白,由MDR1基因编码,Mr为170000。Pgp蛋白属于ATP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)转运蛋白超家族,是ATP依赖性的药物外排泵,能将各种不同的药物排出细胞,从而产生MDR。已经证实Pgp蛋白与肿瘤复发和预后差高度相关,是评价肿瘤预后的重要指标之一。以Pgp为治疗靶点已经成为克服肿瘤耐药的新策略。Diabody是双特异性抗体(Bispecific antibody)的一种构建形式之一。通常是两个具有不同抗原结合位点的抗体可变区序列,在同一个启动子控制下组成两个顺反子,同一顺反子中VH和VL用一个短Linker连接。表达产物中同一顺反子上的V_H和V_L因Linker太短而存在空间位阻,不能配对,只能与另一顺反子上的V_H和V_L配对,共价结合形成二聚体。Diabody分子量在55-60 kDa,肿瘤穿透性强;缺乏Fc段,副作用小;Diabody能够将体内细胞毒性T细胞靶向到肿瘤细胞表面,直接发挥细胞毒杀伤效应,避免了使用外源性非特异性细胞毒性物质,并且不受MHC限制。抗CD3/抗Pgp Diabdoy具有良好的临床应用前景。但是,由于Diabody自身结构特点,两条肽链是通过非共价键结合在一起,容易解离而失去活性。向Diabody引入二硫键,可以大大增强其稳定性,并且不影响抗体亲和力,甚至亲和力增加。T细胞活化需要协同刺激信号,否则,T细胞不但不能有效活化,还会处于无能状态。B7分子是协同刺激分子最主要的家庭成员,它包括两种分子:CD80和CD86。文献报道,化疗药物阿糖胞苷(ARA-C)能够诱导肿瘤细胞高表达B7分子。因此,我们推测抗CD3/抗Pgp Diabdoy和ARA-C联合应用可以增强细胞毒性T细胞的活性,达到更好的治疗效果。本实验室构建了抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体(Diabody),并进行原核可溶性表达,体外实验证实具有良好的生物学活性,体内实验证实能有效地介导细胞毒性T淋巴细胞杀伤耐药移植瘤细胞。抗CD3/抗Pgp Diabody带有15肽的Etag纯化标记,可能引起免疫原性,影响其临床应用价值。并且抗CD3/抗Pgp Diabody在体内实验中,停药一周后肿瘤复发,不能彻底根除肿瘤。可能与体外活化的T细胞在体内不能维持其持续活化的状态,以及Diabody不稳定有关。本实验主要对抗CD3/抗Pgp Diabody进行了两项改进,分别为:①通过基因工程技术将抗CD3/抗Pgp Diabody的纯化标签Etag去除,降低免疫原性。与ARA-C联合应用治疗耐药裸鼠移植瘤。②向抗CD3/抗Pgp Diabody的抗CD3或抗Pgp可变区引入一对二硫键,增强其稳定性,提高疗效。实验结果显示,去除Etag的抗CD3/抗Pgp Diabody生物学活性没有明显改变,与ARA-C联合应用,疗效大大增强,在观察窗内肿瘤没有复发。向抗CD3/抗Pgp Diabody的抗Pgp可变区引入一对二硫键后,二硫键不能正确配对。而向抗CD3/抗Pgp Diabody的抗CD3可变区引入一对二硫键后(dsCD3-Diabody),二硫键能够正确配对,在原核系统可溶性表达。dsCD3-Diabody抗原结合活性没有明显改变,介导细胞毒性T细胞发挥杀伤效应的能力亦没有明显改变,而体内外稳定性大大增强,介导细胞毒性T细胞杀伤耐药移植瘤的作用增强一倍。近二十年来,已经证实存在肿瘤干细胞,肿瘤干细胞的存在可能是肿瘤复发难治的根源。最近研究显示,急性髓系白血病(AML)细胞上PgP蛋白的表达明显高于其他亚群的细胞,这样白血病干细胞(LSC)就容易逃脱化疗药物的杀伤作用,重新生长并增殖。研究同时发现,LSC上的Pgp蛋白虽然数量增多,但是其功能是降低的,这可能是ABCB1逆转剂临床治疗效果并没有预期那么好的原因之一。我们研制的抗CD3/抗Pgp Diabody是通过识别Pgp蛋白的三维结构,与之特异性结合,从而介导细胞毒性T细胞发挥细胞杀伤效应。因此,抗CD3/抗Pgp Diabody较ABCB1逆转剂具有更好的临床应用价值。