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目的 探讨利用脂质体介导的转基因技术将抑癌基因PTEN转入人胆管癌细胞,联合化疗药物奥沙利铂(L-OHP),分别进行人胆管癌细胞(QBC939)体外培养和体内接种生长、观察、分析该基因对胆管癌细胞生长的抑制情况,探索人类胆管癌的生物治疗的可行性和方法。 方法 1.将携带PTEN基因的真核表达载体pBP-PTEN和不含该基因的空载体pBP-puro转化DH5α大肠杆菌中并扩增,提取和纯化质粒DNA,酶切、电泳测定。用Lipofectamine将pBP-PTEN和pBP-puro质粒转染胆管癌QBC939细胞,嘌呤霉素抗性克隆浓度筛选,挑选阳性细胞克隆、扩增培养。转染细胞分为pBP-PTEN-QBC组、空质粒pBP-QBC组,未转染组QBC细胞为对照组。2.绘制细胞生长曲线及四甲基氮唑盐法酶联光吸试验(MTT):观察转染PTEN基因前后QBC939细胞的生长情况,并绘制生长曲线。3.免疫组化:运用S-P免疫组化法,检测QBC939细胞转染前后PTEN阳性表达率。4.体外细胞侵袭力抑制试验:区带微孔膜分上下室的6孔培养板,上室分别按每孔细胞数为1×10~6/ml置入PTEN-QBC组(转染组)、QBC939对照组细胞悬液,并每组随机取两孔加入0.5%/L的奥沙利铂(L-OHP),下室中加入含趋化因子的无血清培养基,侵袭至膜下表面的细胞行HE染色,选5个400倍显微镜视野,统计各组细胞数,并以侵袭细胞的相对数目表示细胞的侵袭力。5.流式细胞分析仪:取细胞数各为2×10~7/ml的上述4组细胞,进行流式细胞仪检测,观测各组细胞的周期G1到S期的变化和细胞凋亡情况。6.透射电镜扫描:取QBC939对照组、空质粒pBP-QBC和转基因组PTEN-QBC细胞,分别观察PTEN基因转染前后QBC939细胞的形态及细胞微结构的变化。7.体内肿瘤生长抑制试验:将24只6周龄雌性BALB/c裸鼠随机分为4组,每组6只,分别命名为QBC和PTEN各两组,QBC两组共12只裸鼠,每只右前肢皮下接种细胞数为1×10~7/ml的对数生长期QBC939细胞,PTEN组12只相同