新戊丙酯菌素是阿维链霉菌等放线菌产生的一种倍半萜类化合物,其倍半萜碳骨架的氧化后修饰仍存在一些问题未研究清楚。文献报道的体内基因缺失实验证实了非血红素铁/α-酮戊二酸（NHFe/α-KG）依赖的双加氧酶编码基因ptl D负责新戊丙酯菌素生物合成的最后一步氧化修饰,与内酯环的形成直接相关。但是,体外生物化学实验结果显示Ptl D仅能催化新戊丙酯菌素D发生去饱和反应生成新戊丙酯菌素E,反应体系中并未检测到含有环氧乙烷结构的新戊丙酯菌素F或含有酮基内酯环的终产物新戊丙酯菌素。本课题的研究目标即通过对Ptl D进行体外生物化学研究,详细表征其酶学特性,揭示它在新戊丙酯菌素生物合成途径中发挥的作用。本研究主要分为三部分,首先是Ptl D蛋白质催化的酶学反应底物的制备。我们在已经敲除了细胞色素P450单加氧酶编码基因SAV＿7469的阿维链霉菌中再对ptl D基因进行敲除。从双敲除突变株发酵产物中分离得到了Ptl D的底物新戊丙酯菌素D。高分辨质谱,核磁共振氢谱、碳谱和二维谱分析结果表明分离得到的新戊丙酯菌素D结构正确,与文献报道的谱图完全一致。第二部分工作是Ptl D蛋白质的超量表达。我们合成密码子优化的ptl D基因,将其装载到p ET28a质粒上,利用大肠杆菌超量表达系统表达Ptl D蛋白并在无氧条件下进行了蛋白纯化。得到底物和Ptl D蛋白质以后,我们开展了第三部分的工作,即体外生物化学实验。实验结果表明,当α-KG与新戊丙酯菌素D的摩尔比为1:1时,主产物为在新戊丙酯菌素D的C9位和C10位之间去饱和化的新戊丙酯菌素E,副产物为新戊丙酯菌素E内酯开环的化合物（15）。我们设置了新戊丙酯菌素E水解反应实验,且未观察到新戊丙酯菌素E向化合物15转化。所以,化合物15并非新戊丙酯菌素E的水解产物,而是可能由底物新戊丙酯菌素D的C9位被羟化后再重排生成的化合物。当反应体系中α-KG与新戊丙酯菌素D的摩尔比为2:1时,新戊丙酯菌素E并未出现在产物中,HPLC分析发现了3种新的产物,分别是化合物13、14和17。在纯化化合物13的过程中,我们发现它不稳定,会大量转化为化合物16。高分辨质谱分析结果显示,化合物13与含有环氧乙烷结构的新戊丙酯菌素F分子量一致。当我们以新戊丙酯菌素E为底物时,Ptl D亦能催化生成化合物13,这进一步暗示化合物13就是新戊丙酯菌素F。详细的结构鉴定表明,化合物14是新戊丙酯菌素。化合物16和17的结构也得到了鉴定,它们不是酶学反应产物,分别是新戊丙酯菌素F水解和醇解的产物。综上所述,我们的研究结果证实,Ptl D在新戊丙酯菌素生物合成途径中同时发挥着去饱和化和环氧化的功能。它首先将新戊丙酯菌素D去饱和化生成新戊丙酯菌素E;再催化新戊丙酯菌素E环氧化,生成具有环氧乙烷基团的新戊丙酯菌素F。新戊丙酯菌素F不稳定,可以自发重排形成新戊丙酯菌素,同时也可能发生水解或者醇解。NHFe/α-KG依赖的双加氧酶Ptl D体外生物化学活性的揭示,填补了我们对新戊丙酯菌素生物合成途径的认知缺口。