论文部分内容阅读
研究背景TGFβ-1及其信号转导通路在特发性肺纤维化的发病机制中起关键作用,而Smad2、Smad3是TGFβ-1信号通路中重要的转录因子。UCH-L5是一种DUBs,可以逆转多聚泛素化的底物蛋白经蛋白酶体降解,对于调节蛋白功能及信号转导具有重要意义。有报道指出UCH-L5可以与Smad7相互作用,逆转Smurf介导的TβRI泛素化,增加TβRI的稳定性,增强TGFβ-1信号转导。可是UCH-L5对于Smad2和Smad3的调节机制以及在肺纤维化疾病中的作用还不清楚。本研究主要针对UCH-L5对Smad2/Smad3蛋白泛素化及蛋白稳定性的影响,探讨UCH-L5在特发性肺纤维化疾病发病机制中的作用,及其作为新的临床治疗靶点的可能性。实验方法(1)本研究采用免疫印迹法测定TGFβ-1刺激HLF后,b-AP15对UCH-L5和TGFβ-1信号转导通路中受体ALK5、转录因子Smad2、3、7以及目的蛋白FN、α-SMA表达水平的影响;使用免疫荧光染色法确认b-AP15对于TGFβ-1刺激HLF细胞后FN、α-SMA表达水平的影响。(2)使用IU1和不同浓度b-AP15刺激HLF或Mrc5细胞,然后使用免疫印迹法测定b-AP15对于ALK5、Smad2、Smad3、Smad7表达水平的影响。对比IU1和b-AP15对TGFβ-1信号转导通路的作用。(3)使用qPCR法测定b-AP15刺激后HLF细胞中Smad2和Smad3 m RNA水平。(4)使用空载体质粒和HA-Ubi K0质粒转染HLF细胞,测定b-AP15对Smad2、Smad3的作用是否受到蛋白多聚泛素化的影响。使用免疫沉淀法及免疫印迹法证实b-AP15对于Smad2、Smad3多聚泛素化水平的作用。(5)使用Leupeptin、MG-132或者bafilomycin A1预处理HLF细胞,然后使用免疫印迹法观察b-AP15对Smad2和Smad3的作用是否受到影响。(6)使用bafilomycin A1预处理HLF细胞,然后利用溶酶体示踪染色法进行免疫荧光染色,确认b-AP15刺激后Smad2、Smad3和溶酶体在细胞中的位置。(7)使用空载体质粒或UCH-L5质粒转染MLE12细胞,然后用CHX刺激细胞,利用免疫印迹法观察UCH-L5对Smad2、Smad3半衰期即蛋白稳定性的影响。(8)使用scramble sh RNA和UCH-L5 sh RNA转染细胞,或者使用空载体质粒和UCH-L5质粒转染HLF细胞,然后使用免疫沉淀法及免疫印迹法检测Smad2、Smad3多聚泛素化水平,证实UCH-L5对Smad2、Smad3蛋白多聚泛素化的作用。(9)使用免疫共沉淀法检测UCH-L5与Smad2/Smad3蛋白是否结合。再使用野生型Flag-Smad3质粒以及Smad3点突变质粒Flag-Smad3T66A、Flag-Smad3T66D质粒转染HLF细胞,利用免疫共沉淀法检测UCH-L5和Smad3结合位点。(10)经鼻给与C57BL/6小鼠PBS或博来霉素(0.045 U),建立博来霉素诱发肺纤维化的动物模型。为了观察b-AP15在动物体内的治疗作用,第11天起腹腔注射b-AP15(5 mg/kg,隔日一次)。第21天留取小鼠的肺组织进行HE染色及Masson三色染色,观察肺组织胶原蛋白沉积情况;利用免疫印迹法观察肺组织裂解液中Smad2、Smad3、p38、UCH-L5、FN、胶原蛋白表达量的变化。实验结果(1)b-AP15减弱TGFβ-1信号转导通路;(2)b-AP15通过增强蛋白多聚泛素化及其经溶酶体降解,减少Smad2/Smad3蛋白表达;(3)UCH-L5稳定Smad2/Smad3的蛋白水平,增强TGFβ-1信号转导;(4)UCH-L5通过与Smad3蛋白结合调节Smad3蛋白的降解;(5)UCH-L5是潜在的药物治疗靶点。结论(1)UCH-L5能够使Smad2、Smad3蛋白去泛素化,增加Smad2、Smad3蛋白的稳定性,增强TGFβ-1信号转导通路,促进肺纤维化的发病。(2)UCH-L5抑制剂b-AP15能够减弱TGFβ-1信号转导通路,减轻博来霉素诱发的肺纤维化小鼠肺纤维程度。(3)UCH-L5可能是治疗IPF新的治疗靶点。