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目的:衰老是正常的生命过程,生物衰老机制极其复杂,与肝脏糖代谢功能紊乱有着密切的联系。蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A,PP2A)是细胞内重要的蛋白磷酸酶,通过催化丝氨酸/苏氨酸去磷酸化修饰,参与信号转导、基因表达、细胞代谢、细胞增殖分化及细胞凋亡等过程的调控。PP2A 催化亚基 C 亚基(Protein phosphatase 2A catalytic subunit C,PP2Ac)可在亮氨酸甲基转移酶(leucine carboxyl methyltransferase,LCMT1)催化下甲基化,并由竣基甲基酯酶(carboxy methylesterase 1,PPME-1)可逆性催化其去甲基,调控PP2A合酶组成、活性及底物特异性,进而影响其功能。目前PP2Ac甲基化在衰老及肝脏糖代谢调节中的作用尚未明确。前期研究结果发现细胞衰老过程伴随PP2Ac甲基化改变,但尚未知晓在动物模型中机体衰老过程PP2Ac甲基化的变化规律。前期研究还发现,能量限制可调节糖异生及葡萄糖转运相关基因表达,增加肝脏糖原储存,调控衰老相关糖代谢平衡紊乱,但尚未知晓肝脏PP2Ac甲基化是否参与糖代谢调控,以及二者之间的因果关系。因此,本研究利用动物模型探讨机体衰老过程各主要脏器PP2Ac甲基化修饰的变化趋势,并在能量限制干预衰老的SD大鼠模型中探讨PP2Ac活性与甲基化,以及糖代谢相关激素的变化,以明确PP2Ac甲基化改变与前期研究结果中衰老相关糖代谢调控的相关关系。同时,在细胞模型利用对PP2A具有调节作用的白藜芦醇处理细胞,以及siRNA技术沉默LCMT1细胞模型,采用上述两种方式调控细胞内PP2Ac甲基化水平,探讨PP2Ac甲基化在肝细胞糖代谢调控作用中的因果关系。方法:1.自然衰老过程中大鼠主要脏器PP2Ac及其甲基化修饰改变(1)分组:幼龄组(4周龄)、年轻组(5月龄)、中年组(15月龄)、老龄组(27月龄)。检测实验终点时各组大鼠体重、肝重及取大鼠肝脏组织切片HE染色观察形态变化。(2)蛋白免疫印迹检测幼龄组、年轻组、中年组及老龄组大鼠肝、肾脏、肺、心脏和大脑皮层组织PP2Ac及其甲基化修饰的情况。2.能量限制干预衰老对PP2Ac活性和甲基化修饰及血糖调节激素的影响(1)能量限制大鼠分组:老龄组(27月龄)及能量限制组(12月龄大鼠40%能量限制15个月)。检测实验终点时两组大鼠肝脏组织切片HE染色观察形态变化。(2)蛋白免疫印迹检测老龄组及能量限制组大鼠肝组织PP2Ac及其甲基化修饰的情况(3)免疫沉淀法检测两组大鼠肝组织PP2A活性的表达情况。(4)酶联免疫吸附法检测老龄组及能量限制组大鼠血浆胰岛素、瘦素、脂联素的表达水平。3.PP2Ac甲基化在肝细胞糖代谢调控中的作用3.1白藜芦醇处理细胞探讨PP2Ac甲基化对糖异生相关基因表达的影响(1)使用刃天青检测不同浓度白藜芦醇处理MIHA细胞的活性,确定最适白藜芦醇浓度。(2)蛋白免疫印迹检测白藜芦醇处理各组细胞PP2Ac及其去甲基化变化情况。(3)实时荧光定量PCR检测糖异生相关基因丙酮酸羧化酶(PC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PCK1)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶2(PCK2)的mRNA表达情况。3.2沉默LCMT1调控PP2Ac甲基化对糖代谢调控的影响(1)siRNA LCMT1 MIHA细胞模型构建:设计和化学合成siRNA LCMT1干扰序列,脂质体Lipofectamine3000转染MIHA细胞,RT-PCR检测LCMT1 mRNA表达情况,蛋白免疫印迹检测LCMT1蛋白和PP2Ac及其去甲基化变化情况。(2)实时荧光定量PCR检测siRNA沉默LCMT1细胞和对照组细胞糖异生相关基因PC、PCK1和PCK2的mRNA表达情况。(3)蒽酮法检测siRNA沉默LCMT1细胞和对照组细胞糖原含量。结果:1.自然衰老过程中大鼠主要脏器PP2Ac及其甲基化修饰改变(1)大鼠体重从幼龄至中年随着年龄的增长体重逐渐增加(P<0.05)。幼龄至中年随着年龄的增长大鼠肝脏重量逐渐增加,差异有统计学意义(p<0.05)。大鼠肝脏系数变化趋势是从幼龄期至年轻期随着年龄的增加肝脏系数呈下降趋势,差异有统计学意义(p<0.05)。肝脏组织HE染色形态学观察:大鼠从幼龄至老龄随着年龄的增长肝细胞逐渐变大,至中年及老龄肝组织有明显的病理改变,肝细胞索消失,核固缩,细胞肿胀,出现空泡样变性。(2)对于肝脏组织,与幼龄组相比,年轻组的PP2Ac去甲基化蛋白明显上升,差异有统计学意义(p<0.05);老龄组的PP2Ac去甲基化蛋白表达量明显较年轻组低,差异有统计学意义(p<0.05);四组大鼠总PP2Ac、LCMT1及PPME-1蛋白表达量无明显变化,差异无统计学意义(p>0.05)。(3)对于肾脏组织,年轻组、中年组大鼠的PP2Ac去甲基化蛋白表达量明显较幼龄组高,差异有统计学意义(p<0.05);与年轻组相比较,老龄组的PP2Ac去甲基化状态显著下降,差异有统计学意义(p<0.05);四组大鼠总PP2Ac、LCMT1及PPME-1蛋白表达量无明显变化,差异无统计学意义(p>0.05)。(4)老龄组大鼠肺组织PP2Ac去甲基化蛋白表达水平与幼龄组、年轻组、中年组相比均显著上升,差异有统计学意义(p<0.05);四组大鼠总PP2Ac、LCMT1及PPME-1蛋白表达量无明显变化,差异无统计学意义(p>0.05)。(5)对于心脏组织,四组大鼠总PP2Ac、PP2Ac去甲基化、LCMT1及PPME-1蛋白表达量无明显变化,差异无统计学意义(p>0.05)。(6)对大脑皮层,四组大鼠总PP2Ac、PP2Ac去甲基化、LCMT1及PPME-1蛋白表达量无明显改变,差异无统计学意义(p>0.05)。2.能量限制干预衰老对PP2Ac活性和甲基化修饰及血糖调节激素的影响(1)能量限制组大鼠肝脏HE染色结果未出现明显病理改变。(2)能量限制组大鼠肝组织与老龄组相比较PP2Ac去甲基化蛋白水平升高,差异有统计学意义(p<0.05)。能量限制组大鼠肝组织PP2A活性和老龄组相比无明显变化,差异无统计学意义(p>0.05)。(3)能量限制组大鼠和老龄组相比较血浆胰岛素、瘦素及脂联素水平无差别,差异无统计学意义(p>0.05)。3.PP2Ac甲基化在肝细胞糖代谢调控中的作用3.1白藜芦醇处理细胞探讨PP2Ac甲基化对糖异生相关基因表达的影响(1)白藜芦醇浓度为20μM时活性最大,选用白藜芦醇浓度为20μM作为最佳浓度进行后续实验。(2)单纯使用白藜芦醇处理MIHA细胞与对照组相比总PP2Ac的蛋白表达量明显上升,差异有统计学意义(p<0.05),PP2Ac去甲基化蛋白与总PP2Ac蛋白的比值明显下降,差异有统计学意义(p<0.05)。白藜芦醇+ABL127处理MIHA细胞的总PP2Ac的表达量较空白对照组明显升高,差异有统计学意义(p<0.05),PP2Ac去甲基化蛋白与总PP2Ac蛋白的比值明显下降,差异有统计学意义(p<0.05)。白藜芦醇+OA处理MIHA细胞与单纯使用白藜芦醇组相比总PP2Ac的表达量明显下降(p<0.05),PP2Ac去甲基化蛋白与总PP2Ac蛋白的比值明显上升,差异有统计学意义(p<0.05)。(3)与对照组相比,单纯使用白藜芦醇组PCK1及PCK2mRNA表达量上升,差异有统计学意义(p<0.05)。白藜芦醇组与对照组、白藜芦醇组+OA组相比PCK2表达量均呈现上升趋势,差异有统计学意义(p<0.05)。白藜芦醇+ABL127组与对照组、白藜芦醇组+OA组相比PCK2表达量均增多,差异有统计学意义(p<0.05)。3.2沉默LCMT1调控PP2Ac甲基化对糖代谢调控的影响(1)siRNA LCMT1组MIHA细胞较对照组LCMT1mRNA及蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义(p<0.05);siRNALCMT1组PP2Ac去甲基化蛋白水平较对照组高,差异有统计学意义(p<0.05)。成功构建有功能的siRNALCMT1 MIHA细胞模型。(2)siRNA LCMT1组与对照组细胞相比PCK1 mRNA表达量明显下降,差异有统计学意义(p<0.05)。(3)siRNALCMT1组糖原含量较对照组细胞明显升高,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:1.在自然衰老过程中PP2Ac甲基化水平的变化情况存在组织器官特异性。2.自然衰老大鼠肝脏组织PP2Ac去甲基化水平在衰老过程中呈下降趋势,能量限制逆转衰老引起的PP2Ac去甲基化下降。3.PP2Ac去甲基化下调PCK1糖异生基因表达,增加肝细胞糖原含量。