纳塔，也称细菌纤维素(Bacterialcellulose，BC)，是由微生物产生的一类纯纤维素。它是由β-D-葡萄糖通过β-1,4-葡萄糖苷键结合成的直链，直链间彼此平行，不呈螺旋构象，无分支结构，又称为β-1,4-葡聚糖。BC的发现至今已有一百多年的历史，但由于生产成本高，对其物理特性了解不够充分，以致其应用受到限制。最近十几年随着对BC生物合成机制的深入了解，以及发酵条件的改善，BC的工业应用逐步加速。目前，BC主要应用于附加值较高的领域。在声音振动膜、高强度纸、新型伤口包扎材料等产品的研制中已进入实用化阶段，在其他方面也具有广泛的商业化应用潜力。关于BC的研究已成为当今新的微生物合成材料研究的热点之一 纤维素合成酶对BC合成具有重要的影响。BC的最终合成是依赖于纤维素合成酶完成的，纤维素合成酶活力的高低，表达量的多少，直接影响到BC的合成及产量高低。然而纤维素合成酶的活力又与环鸟苷酸相关，环鸟苷酸(cyclicdiguanylicacid，c-di-GMP)是纤维素合成酶的变构激活剂，在BC的生物合成中，如果纤维素合成酶的变构位点上没有结合环鸟苷酸，纤维素合成酶将不具有活性。环鸟苷酸的合成与降解又与二鸟苷酸环化酶(GC)和磷酸二酯酶(PDE)有关。二鸟苷酸环化酶催化环鸟苷酸的合成，磷酸二酯酶催化环鸟苷酸的降解。 本课题的研究思路就是通过提高纤维素合成酶变构激活剂的量，达到提高细菌纤维素合成酶活力，使更多的脲苷二磷酸葡萄糖(UTPG)转化为纤维素的目的。因此，利用插入失活的原理，敲除编码PDE的基因pde基因，阻断PDE的合成，提高细菌纤维素合成酶活力，在理论上是可行的、合理的。虽有学者推测在培养基中添加PDE抑制剂，提高纤维素合成酶活力，但未见有研究性资料。因此，利用基因工程技术阻断PDE对环鸟苷酸的抑制，提高细菌纤维素合成酶活力是本课题的创新点。 本研究以筛选的BC生产菌为试验菌，通过敲除对纤维素合成酶变构激活剂有抑制作用的pde基因，解除磷酸二酯酶(PDE)对细菌纤维素合成酶激活剂的降解作用，构建高产菌株。研究内容包括：1)提取并扩增pde基因，通过试验确定能大量扩增pde基因的最佳条件；2)利用基因敲除法获得pde基因；3)选择合适的载体，将失活基因重组到试验菌株中，确定适宜的重组条件；4)筛选、鉴定重组子并对所得重组菌株进行遗传稳定性研究；5)对重组菌株进行发酵验证研究。 本研究确定了一种纤维素生产菌株菌体细胞收集方法，收集条件为：种子液接种量2mL，涂布于φ12cm的平板培养基，培养24h，刮膜至10mL无菌水中，漩涡混合仪振荡1min，无菌脱脂棉过滤，滤液在12000r/min下离心10min即可。 本研究分别考察了pde基因片断、ampr基因PCR扩增时影响最大的两个因素：Mg2+浓度和复性温度。确定pde基因片断PCR扩增时Mg2+浓度为3mM，复性温度为50℃；ampr基因PCR扩增时Mg2+浓度为为2mM，复性温度为36℃。 本研究利用基因敲除的原理，成功构建了pde-基因，同时将pde-基因重组到试验菌株中，构建了pde-基因型重组菌株。 本研究对pde-基因型重组菌株进行了发酵研究，比较了重组菌株与出试验菌株BC产量，得出：所筛选10株pde-基因型重组菌株BC产量均稍有提高，最大产率提高了4.8％，但提高幅度不是很大，原因可能是细胞体内PDE不能表达后，引起代谢途径发生改变。原来的发酵条件可能已经不适合重组菌株的发酵生产。因此pde-基因型重组菌株BC产量的提高还有待于进一步研究。 本研究最后对重组菌株遗传稳定性进行了考察，结果证明，连续转接三代之后，重组菌株pde-基因型仍然存在，说明其遗传稳定性良好。 本项目的意义在于从基因水平探索改造BC生产菌种的途径，为选育高产菌株，构建适用于规模化生产的工程菌，降低生产成本奠定了理论基础，提高我国BC的规模化生产水平，促进BC在国内的市场开发和应用。