延伸因子ELP3和ELP4基因在甘蓝型油菜抗菌核病中的功能初步研究

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甘蓝型油菜(Brassica napus L.)属于十字花科芸薹属,是全世界重要的油料栽培作物。油菜籽是我国关键的植物油来源和重要的植物蛋白质来源,可用作食品,生物能源,动物饲料等。我国近年来年平均种植面积达到约714万公顷,占全球油菜总种植面积20%以上。中国在2017年油菜总产量高达1300多万吨,占世界油菜总产量约17%,位居世界总产量前三位(FAOSTAT数据)。但近年来菌核病给农业生产带来巨大的资源浪费和经济损失。使用化学防治等方法来防治油菜菌核病会对环境造成严重伤害,研究甘蓝型油菜抗菌核病的分子机理和培育抗菌核病的甘蓝型油菜品种是解决这一问题的最有效方法。延伸因子复合体是高等植物免疫过程中重要的调节因子。近年来,延伸因子Bn ELP3和Bn ELP4在拟南芥免疫过程中的功能受到关注,但在甘蓝型油菜中这些基因的功能尚未得到验证。本研究通过生物信息学、分子生物学和基因工程等技术,克隆了甘蓝型油菜的Bn ELP3和Bn ELP4基因,同时构建了Bn ELP3和Bn ELP4的过表达载体,将构建成功的两个载体通过农杆菌转入甘蓝型油菜,并对过表达Bn ELP3和Bn ELP4的转化后代进行抗核盘菌的鉴定和相关抗病基因的表达模式分析,验证延伸因子在油菜抗菌核病过程中的功能。获得研究结果如下:1.根据在NCBI数据库中检索的甘蓝型油菜Bn ELP3和Bn ELP4基因预测序列,设计特异性的引物,甘蓝型油菜Westar叶片中成功克隆出了Bn ELP3和Bn ELP4基因。2.成功构建了p CAMBIA1300-2301-Bn ELP3和p CAMBIA1300-2301-Bn ELP4两个过表达载体。3.将上述构建成功的载体转化至感受态农杆菌EHA105中,利用农杆菌侵染导入到甘蓝型油菜Westar的外植体中,并利用卡那霉素进行转化植株筛选。经过卡那霉素基因PCR扩增鉴定阳性苗,分别得到p35S::Bn ELP3T0代阳性植株3株,T1代阳性植株6株;p35S::Bn ELP4T0代阳性植株6株,T1代阳性植株19株。4.分别对过表达植株进行基于表达分析,发现T0代过表达Bn ELP3中3株表达量显著上调,T0代过表达Bn ELP3中2株表达量显著上调,T1代过表达Bn ELP4中6株表达量显著上调,T1代过表达Bn ELP4中17株表达量显著上调。5.对转化后代接种核盘菌后,T0代过表达Bn ELP3中相关抗病基因的表达进行了分析,发现接菌36 h(36hpi)时叶片内一些抗病相关基因ELP4、PDF1.2、PR1相对表达量显著高于野生型。在T1代过表达Bn ELP4接菌后,发现PDF1.2、Chitinase、NPR1、ERF1、ORA59相对表达量显著上调。此外,甘蓝型油菜核盘菌接种36hpi后,转化植株及其后代的病斑面积显著下降。病斑的统计结果表明Bn ELP3和Bn ELP4在油菜抗菌核病中具有正向调控作用。6.提取转基因油菜T1代过表达的Bn ELP3和Bn ELP4叶片成分,体外模拟了抑制核盘菌生长的过程,发现在Bn ELP3阳性株系中一些体外蛋白质和其它次生代谢物能有效抑制核盘菌的生长,说明过表达Bn ELP3在抗菌核病中有正向调控作用。该研究将为下一步研究延伸因子Bn ELP3与Bn ELP4基因在加强甘蓝型油菜抗病能力和在甘蓝型油菜抗病过程中的分子机理上提供了理论指导和材料基础。
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