探讨蛋白尿发生的分子机制和寻找减少蛋白尿产生的“特效”治疗药物一直是人们关心的热点问题。已有的研究显示肾小球滤过屏障功能受损是导致蛋白尿发生的核心事件,而做为构成该屏障最外层的足细胞损伤则是蛋白尿形成的最关键因素之一足细胞足突发生融合是大多数蛋白尿疾病中最常见的病理改变之一,足细胞骨架重排引起足细胞活动力升高是导致足突融合发生的分子基础。整合素做为介导细胞粘附参与细胞活动力改变的关键分子,有研究显示在足细胞上除已知的整合素β3β1外,还存在αVβ3亚型。其中,该亚型的β3亚基活化后,通过激活胞内下游信号分子如Rho家族GTP酶-Cdc42和rac1,进而引起足细胞活动力升高,细胞突触广泛融合。研究认为,病理状态下整合素p3亚基的活化是导致大量蛋白尿形成的关键因素之一。但其活化的分子机制仍不清楚。血管生成素样蛋白3 (angiopoietin like 3 protein, ANGPTL3)属于血管生成素样蛋白家族,已有的报道认为其主要由肝细胞合成,在肾脏仅有微弱表达。ANGPTL3由于具有强大的抑制脂酶活性的能力,迄今为止针对该分子的研究主要集中在脂质代谢领域,有关ANGPTL3在肾脏病中的研究尚缺乏深入报道。近期,我们研究小组在通过基因芯片技术发现肾病患儿肾组织高表达ANGPTL3后,进一步证实该分子主要由肾小球的足细胞表达,其表达量与足突融合及蛋白尿的严重程度呈正相关,体外实验还发现ANGPTL3能够通过结合肾小球内皮细胞表面的整合素aVβ3导致肾小球内皮细胞通透性升高,提示ANGPTL3可能参与了蛋白尿的发生。本课题拟在明确ANGPTL3与整合素β3在足细胞中的亚细胞分布和共定位关系的基础上,探讨足细胞分泌ANGPTL3后能否活化自身整合素β3从而导致骨架重排的作用特点,深入研究ANGPTL3对足细胞整合素β3亚基下游骨架调控相关信号分子的活化机制,以揭示足细胞分泌ANGPTL3后可活化自身整合素β3及其下游信号分子促发细胞骨架重排、足细胞活动力升高进而可能参与足突融合、蛋白尿发生的新机制。1.肾小球足细胞特异性表达ANGPTL3本次研究对人和大鼠肾小球中ANGPTL3的表达分析显示与我们前期的报道相一致,ANGPTL3在正常肾小球中的表达量要显著低于肾病肾小球中的表达水平,ANGPTL3与足细胞的标记蛋白Synapotodin具有良好的共定位关系。进一步利用胶体金标记的免疫电镜技术分析了ANGPTL3在肾小球的精确定位和亚细胞分布特点。结果显示,在人和大鼠的肾小球中,ANGPTL3均由足细胞特异性表达。ANGPTL3在正常和肾病大鼠足细胞中的亚细胞分布有所不同,即在肾病时ANGPTL3主要集中在足突部位,但在正常足细胞中主要集中在足细胞的胞体部。通过western blott和real-time PCR方法我们检测了体外培养的小鼠永生化足细胞合成ANGPTL3的能力。结果证实,阿霉素(Adiamycin, ADR)及嘌呤霉素(Puramycin aminonucleoside, PAN)处理足细胞后均能导致足细胞大量合成ANGPTL3。ELISA检测培养细胞上清ANGPTL3含量结果显示,体外培养的足细胞不仅能够合成而且能够分泌ANGPTL3。2. ANGPTL3能够直接结合足细胞整合素β3免疫荧光染色分别标记ANGPTL3和整合素β3,激光共聚焦显微镜观察可见ANGPTL3与整合素β3在体外培养的正常足细胞上具有良好的共定位关系,提示在足细胞ANGPTL3是整合素β3的配体之一。免疫共沉淀实验进一步证实,与已报道的足细胞整合素β3的配体不同,ANGPTL3与整合素β3的结合方式是直接结合。3. ANGPTL3是调控整合素β3活化的关键配体整合素β3的活化做为导致足细胞活动力升高、蛋白尿发生的关键性事件,我们在本次研究中重点探讨了ANGPTL3对足细胞整合素β3表达及活化水平的调控情况。结果显示,miRNA基因敲低足细胞ANGPTL3表达后,整合素β3表达量也发生下调(P<0.01)；反之,对足细胞瞬时转染ANGPTL3-cDNA后,足细胞在高表达ANPGTL3的同时整合素β3表达水平也发生显著升高(P<0.01)。上述结果提示ANGPTL3是维持正常状态下足细胞整合素β3表达量的重要配体之一AP5做为检测活化状态的整合素β3的特异性单克隆抗体,本次研究我们通过免疫荧光双标的方法分析了病理状态下AP5与ANGPTL3表达的关系。结果显示,与文献报道的LPS处理后的结果相似,阿霉素处理足细胞后能够导致足细胞整合素β3活化水平的显著升高(P<0.01)。但是,当基因敲低足细胞ANGPTL3后,再接受阿霉素刺激并不能够诱整合素β3的活化水平升高,我们的这一发现证实,ANGPTL3不仅能够结合整合素β3同时是病理状态下导致该受体活化的关键配体。4. ANGPTL3导致足细胞骨架重排及细胞活动力升高免疫荧光染色F-actin标记足细胞骨架形态,共聚焦显微镜下观察细胞骨架形态并分析F-actin的表达水平。结果发现,当足细胞基因敲低／ANGPTL3表达后,细胞骨架与阴性对照细胞相比并未发生细胞骨架排列紊乱、F-actin荧光强度显著减弱等细胞骨架重排的表现,提示ANGPTL3对维持生理状态下细胞骨架稳定性并非必备条件。进一步对病理状态下／ANGPTL3对足细胞骨架重排的研究发现,低表达ANGPTL3的足细胞在接受阿霉素刺激后显著缓解阿霉素引起的细胞骨架重排现象。Western blott分析还发现,ANGPTL3对病理状态下足细胞骨架重排的影响不仅包括调控骨架蛋白F-actin表达量和肌纤维排列,也会影响骨架调控蛋白a-actinin-4的表达。我们的研究显示ANGPTL3是导致病理状态下足细胞骨架重排发生的关键分子之一。细胞划痕实验和transwell细胞迁移计数对足细胞活动力活动力的分析显示,足细胞基因敲低ANGPTL3表达后能够明显减轻阿霉素诱导的足细胞活动力升高。我们的结果提示ANGPTL3通过调控足细胞骨架重排可能参与了体内蛋白尿的形成。5. ANGPTL3通过整合素β3/FAK/PI3K/RhoA信号通路诱导足细胞骨架重排对足细胞瞬时基因转染ANGPTL3-cDNA重组质粒,使得足细胞高表达该蛋白后,F-actin免疫荧光标记细胞骨架结构可见足细胞发生显著骨架重排现象。进一步采用针对整合素β3的单克隆抗体封闭足细胞该受体的活化后,我们发现与未封闭β3组相比,封闭组足细胞接受ANGPTL3转染后未发生显著的骨架重排现象,提示,ANGPTL3导致的足细胞骨架重排主要是通过整合素β3信号通路实现。Western blott分析下游信号分子提示,足细胞高表达ANGPTL3后会引起整合素β3下游的FAK, RhoA磷酸化水平的显著升高；进一步使用PI3K抑制剂能够抑制ANGPTL3引起的FAK, RhoA磷酸化水平升高。我们的结果显示,整合素β3/FAK/PI3K/RhoA信号通路是／ANGPTL3诱导足细胞骨架重排发生的主要信号通路之综上所述,通过本课题的研究,我们首次发现足细胞能够特异性表达ANGPTL3。并且证实,在体外,ANGPTL3是调控足细胞整合素β3表达活化的关键配体。ANGPTL3活化足细胞自身整合素β3后,进而引起下游FAK、PI3K、RhoA信号通路活化,触发细胞骨架重排发生,导致了足细胞活动力升高。进一步提示ANGPTL3可能在体内参与了病理状态下足细胞足突融的合形成及蛋白尿的发生。我们对足细胞合成ANGPTL3后诱导足细胞自身整合素β3信号通路活化的研究结果,将有利于拓展人们对病理状态下足细胞自身分泌细胞因子主动参与肾小球滤过屏障损伤机制的新认识,同时本次研究成果也将为蛋白尿形成的分子机制研究提供一个新的参考途径。