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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种传染性疾病。PRRSV属于尼多病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属。根据氨基酸序列差异,PRRSV可分为欧洲型和美洲型两个血清型。由于GP5在受体介导的病毒感染中扮演重要角色,并含有病毒蛋白主要的中和表位,所以制备GP5的单抗,具有重要的应用价值。本研究利用含重组表达质粒pET-GP5的大肠杆菌E. coli BL21(DE3),通过对诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度,诱导时间,诱导温度等一系列条件优化,最终确定在37℃,诱导剂(IPTG)终浓度为0.6mM诱导6h条件下,PRRSV-GP5蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式实现了高效表达。超声波裂解诱导表达菌体,用8mol/L尿素溶解包涵体,经镍螯合亲和层析纯化后,经SDS-PAGE分析表明成功获得了16kDa的变性PRRSV-GP5蛋白,Western blot结果显示表达的GP5蛋白能与猪PRRSV阳性血清发生特异性反应。以重组表达的PRRSV-GP5蛋白作为检测抗原建立了筛选PRRSV GP5单抗的间接ELISA检测方法。以纯化的重组GP5蛋白作为包被抗原,通过检测鼠阳性血清,以猪阳性血清作为竞争抗原,猪阴性血清作对照,筛选出阻断效果比较好的猪阳性血清作为阻断抗体,建立筛选单抗的阻断ELISA方法。通过摸索PRRSV感染细胞的不同时间,以及固定剂,固定时间,一抗和二抗稀释浓度和反应时间等,建立筛选单抗的间接免疫荧光法(IFA:Indirect immunofluorescence)和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA:Immunoperoxidase monolayer assays)。以纯化的重组GP5蛋白按常规方法免疫BALB/c小鼠,三免后效价达到1：6400。细胞融合前3D,尾静脉注射GP5蛋白进行超强免疫。在筛选单抗时应用了阻断ELISA和间接免疫荧光相结合。按常规方法取免疫小鼠脾细胞与NSO细胞进行细胞融合,先利用GP5重组蛋白为检测抗原以间接ELISA进行抗体初筛获得58个阳性克隆(0D450>0.45),再利用猪PRRSV阳性血清以阻断ELISA对阳性细胞克隆进行进一步抗体筛选,对强阳性细胞克隆进行3次有限稀释克隆化后,建立了3株稳定分泌抗GP5蛋白mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为4B7、2C5和2E4。间接ELISA测定细胞培养上清和腹水的效价,其中4B7的细胞培养上清和腹水的效价分别为1：800和1：51200,mAb的Ig亚类均为IgG1。间接免疫荧光和免疫过氧化物酶单层试验结果显示,3株mAb均与感染PRRSV BJ-4株的Marc-145细胞特异性反应,表明其可识别PRRSV天然GP5蛋白的抗原表位。这些功能性单抗的成功制备,为PRRSV的免疫识别与快速检测研究提供了有效的技术手段。