【摘 要】
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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）引起猪的一种急性、高度传染性疫病。2014年,我国南方地区分离到NADC30-like PRRSV毒株,随后几年该毒株流行率迅速攀升。
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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）引起猪的一种急性、高度传染性疫病。2014年,我国南方地区分离到NADC30-like PRRSV毒株,随后几年该毒株流行率迅速攀升。直至今日,该毒株已成为我国PRRSV新的优势流行毒株。针对PRRSV流行毒株研发特异高效的疫苗是进行PRRS防控的关键措施。为了解近年我国部分地区PRRSV流行情况和遗传演化规律,并为新型疫苗候选毒株的研究提供试验基础,本研究对2019年～2020年我国部分地区PRRSV流行毒株进行病原学检测和遗传演化分析;针对主要流行毒株,通过反向遗传技术构建PRRSV经典毒株以及嵌合毒株的感染性克隆并拯救病毒。主要结果如下:1.2019年～2020年我国PRRSV流行株研究。对2019年～2020年收集的4,238份样品,利用RT-PCR法进行病原学检测,结果表明2019年和2020年PRRSV阳性率分别为7.02%和10.57%。空间分布显示,2019年PRRSV在东北地区（10.00%）和华东地区（10.78%）,2020年在西北地区（13.43%）和华南地区（27.17%）的阳性率都较高。进一步对PRRSV ORF5进行测序和遗传进化分析,结果表明近两年的主要流行毒株是MLV-like毒株（亚群1）和NADC30-like毒株（亚群5）,尤其是NADC30-like毒株,2019年和2020年的阳性占比分别为67.61%和45.95%。2.PRRSV嵌合病毒株pMLV+NADC30的构建。以MLV-like毒株基因组为模板,将全长分四个片段扩增,依次连接至p WSK29-CMV载体上,构建出全长质粒pMLV,经转染Marc-145细胞成功拯救出感染性克隆。在此基础上,进一步将NADC30-like毒株的结构蛋白部分（ORF2-7）替换入pMLV相应编码区,构建出pMLV+NADC30嵌合质粒,转染后成功拯救出活病毒。两个拯救病毒生物学特性分析结果显示,pMLV和pMLV+NADC30的生长曲线与亲本毒株MLV相似。3.PRRSV嵌合病毒株pMLV+NADC30稳定性检测。分别测序嵌合质粒及嵌合病毒F5、F10代Nsp2、ORF3、ORF5序列并比对,结果显示嵌合病毒在Marc-145细胞上稳定传代,未发现突变。将嵌合病毒pMLV+NADC30分别与MLV-like毒株、NADC30-like毒株以及HP-PRRSV毒株以不同比例接种Marc-145细胞进行共感染实验,传至F10后病毒噬斑纯化并对Nsp2、ORF3、ORF5测序分析。比对结果显示嵌合病毒与三种不同亚群的毒株共感染时,未发现重组现象,且嵌合病毒pMLV+NADC30复制能力强于MLV-like毒株和HP-PRRSV毒株,弱于NADC30-like毒株。综上所述,分子流行病学发现MLV-like毒株和NADC30-like毒株是近两年我国主要流行毒株,且NADC30-like毒株占比最高;拯救病毒pMLV和pMLV+NADC30能在Marc-145细胞上稳定传代,且具有与亲本MLV毒株相似的增殖动态;嵌合病毒与三种亚群的流行毒株在细胞水平上共感染后较为稳定,未发现毒株间重组现象,且嵌合病毒复制能力强于MLV-like毒株和HP-PRRSV毒株,弱于NADC30-like毒株。
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