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谷氨酸脱羧酶(Glutamate Decarboxylase,GAD,EC 4.1.1.15)是一种磷酸吡哆醛(pyridoxal 5’-phosphate,PLP)类酶,是生物合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的关键酶。GABA具有延缓大脑衰老、降低血压、镇定安神等生理活性,作为一种新型的功能性因子,在食品、医疗、农业等行业具有广泛的应用前景。GAD分布广泛,从单细胞有机体到高级哺乳动物有机体中均有GAD,但一般含量很低,无法大规模生产。由于微生物生长速度快、生长条件简单、成本低等优点。因此,微生物来源的GAD及全细胞生物催化L-谷氨酸钠(L-sodium glutamate,L-MSG)生产GABA已成为研究的热点。前期研究已从一体巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)克隆出编码GAD的基因,并在大肠杆菌中实现异源表达,但重组酶存在酶活低、热稳定性差等问题。为了进一步改善该酶的催化性质,以更好地满足GABA制备的需求。本文采用定向进化、半理性设计等策略对该酶进行分子改造,旨在获得酶活提高、热稳定性改善的突变体,将为GABA的生产和应用提供依据。主要研究结果分述如下。1.Bacillus megaterium GAD 的定向进化采用易错PCR在目的基因中引入随机突变构建突变文库,通过高通量筛选方法进行筛选。经过两轮易错PCR反应,从13000多个突变体筛选到三个酶活提高的突变体 A5-3、E2-4、E3-11,酶活分别为 21.25±0.73 U/mL、18.52±1.90 U/mL、14.11±2.49 U/mL,相比于野生型,酶活分别提高了 210%、185%、118%。以易错PCR筛选得到的酶活最高的三体突变体作为亲本进行DNAShuffling,从4000多个突变文库中筛选到催化活力最高的突变体Z4。酶学性质研究表明,最佳突变体Z4,酶活为24.37±1.77 U/mL,经纯化后比活力达到161.63±3.31 U/mg,为野生型2.91倍。突变酶Z4的Km值与野生酶相差不大,但kcat明显高于野生型酶,说明突变酶对底物的催化效率有所提高。圆二色谱结果及三维建模分析,与野生型相比,四个突变体的二级结构含量变化不大。其中,E2-4的α-螺旋含量为43.1%,高于野生型,导致热稳定性有所提高。而Z4、A5-3、E2-4、E3-11的无规则卷曲均有增加,提高了蛋白质的柔性结构。另外,55位由Ala突变成Asp可能加强了对酶促反应提供H+的能力,34位由Leu突变成Gln有利于疏水作用的增强,提高了酶的稳定性,而325位由Ala突变成Ser可能导致蛋白结构柔性增加,有利于辅酶、底物与酶的结合和产物的释放。供H+能力的增强与蛋白结构柔性的增加可能是突变酶催化效率提高的主要原因,说明运用定向进化策略可以有效地提高Bacillus megaterium GAD的催化活力。2.Bacillus megaterium GAD半理性设计的研究以定向进化获得的酶活提高的突变体的突变位点和影响GAD催化活力的关键位点进行定点饱和突变,建立突变体文库,从3000多个突变体中筛选到突变体A55D、A55E、L34Q、A325S 和 Q346H,其酶活分别为野生型的 332%、227%、238%、215%和163%。运用多点组合突变技术得到催化活力明显提高的突变体A55D/L34Q、A55D/A325S、A55D/L34Q/Q346H,相比野生型,酶活提高了 260%、236%、275%。对突变体55D/L34Q、A55D/A325S、A55D/L34Q/Q346H酶学性质研究表明,最佳突变体A55D/L34Q/Q346H,纯化后比活力达到183.22±3.33 U/mg,为野生型的3.29倍,突变酶A55D/L34Q/Q346H的Km值低于野生型酶,kcat高于野生型酶,表明突变酶对底物的亲和力和催化效率均有所提高;55℃热处理条件下,突变酶A55D/L34Q/Q346H的半衰期t1/2达到24.19 h,比野生型酶延长了 7 h。三维结构建模及圆二色谱结果表明,突变酶A55D/L34Q/Q346H氢键增多,α螺旋数有所上升对蛋白构象起到了稳定作用。346位由Gln突变成His,His在蛋白结构中一般都很保守,残基中的咪唑环可以形成氢键,起到稳定酶蛋白的作用。同时具有供H+储H+能力,提高了酶的催化效率。34位的Leu位于N段无规则卷曲处,突变成Gln后导致疏水作用的增强,提高了酶的稳定性。55位的Ala位于N段的第一条螺旋臂上,该位点突变成Asp,氢键数量增加。说明运用半理性设计策略对Bacillus megaterium GAD进行分子改造不仅提高了酶活,同时提高了酶的热稳定性。3.突变体A55D/L34Q/Q346H转化法制备γ-氨基丁酸的研究选择最佳突变体A55D/L34Q/Q346H,通过对其转化温度、pH、表面活性剂、生长因子、金属离子和底物浓度等影响因素的研究,确定突变体A55D/L34Q/Q346H制备GABA的转化条件。结果表明,突变体A55D/L34Q/Q346H转化温度在50℃,pH为5,底物浓度为125 mM,作为GAD的辅酶的PLP为0.2mM;Mg2+、Ca2+分别为5 mM。在此最适转化条件下,突变体A55D/L34Q/Q346H的转化效率为56.47 g/g*h,为野生型的2.56倍。