论文部分内容阅读
目的1.观察雷帕霉素对食管鳞癌细胞增殖以及Akt表达的影响。2.寻找合理的方法提高食管鳞癌细胞对雷帕霉素的敏感性，为临床食管鳞癌的治疗寻找更加有效的分子治疗靶点。3.观察新合成抗肿瘤化合物OP16对食管鳞癌细胞增殖及Akt/p70S6K信号通路的影响。方法1雷帕霉素对食管鳞癌细胞增殖及Akt表达的影响CCK-8法检测不同浓度雷帕霉素(Rapamycin, Rapa)对食管鳞癌细胞株增殖的影响。Western blot法检测不同浓度(0，25，50，100，200nM) Rapa和50nM Rapa作用不同时间(0，3，6，9，12，15，24h)引起的不同类型的食管鳞癌细胞中p-Akt(Ser473)的激活情况。p70S6K siRNA干扰技术初步观察Rapa作用后引起p-Akt的激活情况。2PTEN和雷帕霉素对EC9706细胞增殖及Akt表达的影响Western blot法检测五种不同类型的细胞株中PTEN、 p-PTEN的表达。pcDNA3.1-PTEN质粒转染EC9706细胞，CCK-8法检测转染前后Rapa对食管鳞癌细胞株EC9706的增殖抑制作用。检测转染前后Rapa对EC9706细胞株中p-Akt(Ser473)表达的影响。荷瘤裸鼠实验观察PTEN和Rapa的体内抗肿瘤活性。3OP16对食管鳞癌细胞增殖及蛋白表达影响CCK-8法检测不同浓度OP16作用48h后对食管鳞癌细胞株增殖的影响。Westernblot法检测不同浓度(0，10，20，30μM)的OP16，20μM的OP16作用不同时间(0，6，12，24h)以及和50nM Rapa联合作用12h对不同类型的食管鳞癌细胞中p-Akt(Ser473)、Akt1/2、p-p70S6K、p70S6K等蛋白表达的影响。结果1. Rapa对五株食管鳞癌细胞均有增殖抑制作用，但是随着Rapa浓度升高，其对KYSE450、KYSE790和ECa109增殖抑制作用并未明显增强；其对EC9706和TE-1细胞增殖抑制率反而下降。当细胞使用Rapa处理之后，EC9706和TE-1细胞株中p-Akt(Ser473)蛋白表达量明显升高，而在其它三株细胞中没有明显变化。EC9706细胞中，siRNA干扰p70S6K表达后能够使p-Akt的表达量升高，体内裸鼠实验也证实了该实验结果。2.实验的五株细胞中都检测到了p-PTEN (Ser380/Thr382/383)的表达，但是未检测到PTEN的表达。将野生型PTEN转染进入EC9706细胞后使细胞增殖减缓，并且抑制了Rapa引起的p-Akt蛋白的表达增加。体内裸鼠实验也证实了该结果。3. OP16能够剂量依赖型地抑制食管鳞癌细胞的增殖，下调细胞中p-Akt(Ser473/Thr308)蛋白，上调细胞中p-p70S6K蛋白的表达。OP16与Rapa联用之后协同抑制食管鳞癌细胞的增殖和Akt/mTOR通路。结论1. Rapa在食管鳞癌细胞EC9706和TE-1引起p-Akt(Ser473)反馈性激活。野生型PTEN能够在EC9706细胞中抑制Rapa引起的p-Akt反馈性激活，提高食管鳞癌细胞对Rapa敏感性。2. OP16和Rapa共同下调Akt/mTOR通路关键蛋白p-Akt和p-p70S6K的表达，对细胞增殖起到协同抑制作用。