论文部分内容阅读
猪病毒性腹泻的主要病原包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)。三种病毒单独感染都会引起仔猪发生严重的腹泻和脱水,造成很高的死亡率,严重危害畜牧业。根据临床症状很难将三种疾病区分开来,常常需要借助实验室检测方法。在早期研究中,病毒的分离鉴定、免疫荧光以及ELISA方法是主要的诊断方法,但是这些方法检测时间较长,敏感性也不高,操作复杂。随着分子生物学的发展,一些学者建立了基于聚合酶链式反应(PCR)检测方法,大大缩短了检测时间提高了检测敏感性,但是只能做到定性检测,很难做到精确定量。因此建立能够快速准确检测这三种病毒的诊断方法显得越来越重要。本实验分别根据PEDV、TGEV、PoRV的ORF3基因、S基因和VP7基因,设计了三对引物进行PCR反应,扩增的目的片段分别为101bp、109bp和150bp,目的片段与载体pMD18-T连接产物转化至TG1感受态细胞,提取重组质粒pMD-ORF3、pMD-S和pMD-VP7,PCR鉴定并测序。重组质粒测OD260并计算其浓度,根据公式计算拷贝数。梯度稀释重组质粒制备标准品,分别建立了检测3种病毒的SYBR Green-I实时荧光定量PCR方法。通过优化引物浓度和退火温度,确立了最佳的反应体系和扩增程序,建立的PEDV、TGEV、PoRV标准曲线且线性关系良好,相关系数分别为0.99841、0.99678和0.99938,扩增效率分别为0.93、1.11、0.95。特异性试验结果:PEDV特异性试验中TGEV、PoRV、PRRSV、CSFV均为阴性;TGEV特异性试验中PRRSV、PoRV、PEDV、CSFV均为阴性;PoRV特异性试验中PRRSV、PEDV、TGEVV、CSFV均为阴性。敏感性试验表明,3种病毒SYBR Green I荧光定量PCR方法的最低检测下限分别为85拷贝/μL、68拷贝/μL、13拷贝/μL,而常规RT-PCR的检出的最低拷贝数分别为8500拷贝/μL、6800拷贝/μL、1300拷贝/μL,前者敏感性比后者提高约100倍。重复性试验结果显示三种检测方法的批内变异系数和批间变异系数均小于5%。说明本实验建立的3种病毒的SYBR Green-I荧光定量PCR方法的特异性、敏感性和重复性良好。应用建立的三种检测方法分别对河南、北京、广东等地的42份临床粪便样品进行检测,同时用常规RT-PCR进行平行试验,PEDV、TGEV、PoRV荧光定量PCR方法检测阳性率分别为73.8%、66.7%、78.6%,常规RT-PCR检测阳性率分别为66.7%、54.8%、64.3%。应用该方法分别对三种病毒的细胞培养物进行检测,自感染后第4-72h之间每隔4h分别收获细胞培养物,检测结果显示PEDV在36h-52h病毒含量最高为104拷贝/μL,TGEV从44h病毒含量增高达到105拷贝/μL,PoRV在28h-44h病毒含量最高为104拷贝/μL。建立了同时检测PEDV、TGEV二重实时荧光PCR方法。该方法通过熔解曲线中Tm值的差异来区分两种病毒,经过多次试验确定PEDV、TGEV的Tm值分别为:78.0±0.5℃、82.0±0.5℃。特异性结果表明,PEDV、TGEV均有特异性峰,而PoRV、PRRSV、CSFV及阴性对照无特性峰;敏感性结果表明,检测PEDV、TGEV最低下限分别为212拷贝/μL和340拷贝/μL;重复性结果表明,这两种病毒的批内重复试验的变异系数(Tm值)分别为:0.32%、0.15%,批间重复试验的变异系数分别为:0.32%、0.35%。本研究成功建立了PEDV、TGEV、PoRV这3种病毒的SYBR Green-I实时荧光定量PCR方法以及同时检测PEDV、TGEV的实时荧光PCR方法,可以作为临床诊断中一种快速的定性且定量的检测方法,为三种病毒的细胞增殖规律的研究以及弱毒疫苗监控提供了准确的检测技术,同时对诊断试剂盒以及这三种病毒致病机制的研究有重要意义。