粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)是一种常见且分布广泛,危害严重的肠道寄生线虫,主要感染犬、人和其它灵长类动物。由于粪类圆线虫独特的生活史,它可以在宿主体内和体外进行交替繁殖。同时粪类圆线虫自由生活雌虫具有性腺合胞体结构,与雌雄同体的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)结构非常相似,因此可以将转基因质粒显微注射至其性腺,达到研究其基因的目的。针对寄生线虫,目前没有有效的疫苗,只能依靠化学药物进行杀灭和控制。但是由于几十年来重复使用几种常用杀虫药物,使得虫体对其产生了耐药性,因此开发抗寄生线虫疫苗和寻找新的潜在的药物作用靶点迫在眉睫,而转基因技术则是应用于研究寄生线虫基因功能所必须的一种重要工具。起源于细菌和古细菌经过长期适应性免疫逐步形成的Ⅱ型成簇的有规律间隔短回文重复系统[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated nuclease 9(Cas9),CRISPR/Cas9],配合向导RNA(g RNA)成为CRISPR/Cas9系统,近年来被改造成为基因组高效定点编辑的新技术。由于它具有设计简单、操作方便、修饰效率高、成本低廉和适用于多种真核、原核生物等多种优势,给遗传操作领域带来了一场革命性的改变。目前CRISPR/Cas9遗传修饰技术在非寄生性的秀丽隐杆线虫中有很多应用,近几年来,该系统也已应用于在几种寄生原虫中。但是,CRISPR/Cas9是否能在寄生线虫中运用,并研究打靶基因的功能仍然是未知数。为此本课题主要进行了以下几个方面的研究:(1)改进和优化长爪沙鼠、建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型本实验对长爪沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型进行了改进和优化,包括感染所使用的i L3数量(从1000条降至170条),缩短粪便的排虫时间(从35天缩短至11天),提高了感染率(从6.5%提高至77.8%),使粪类圆线虫感染长爪沙鼠实验动物模型更加适应我们的研究目的。同时首次建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型,DAPI染色寄生雌虫并观察细胞状态,测定宿主感染前后血液生理,血清生化等多个指标,发现阳性相比阴性嗜酸性细胞百分比增加,血红蛋白和红细胞计数都出现下降,说明虫体成功感染宿主并引起了宿主出血。对感染的比格犬,长爪沙鼠和子午沙鼠的十二指肠进行组织病理检查,可以观察到虫体。对沙鼠体内的寄生雌虫(PF),自感染三期(L3a),后寄生四期(PL4)进行形态学描述。(2)粪类圆线虫自由生活的雄虫的生殖细胞进行转基因研究以Ss-rps-21为启动子,构建表达GFP的转基因质粒p AJ20,用来分别注射自由生活的雌性成虫和雄性成虫。首先尝试将转基因质粒p AJ20通过显微注射到粪类圆线虫自由生活的雌虫性腺,观察到P0代的性腺和子宫内的卵表达了GFP蛋白,其F1代L1全身广泛表达GFP蛋白,并且在其生殖原基(GP)处表达量最高。接着尝试将转基因质粒p AJ20通过显微注射到粪类圆线虫自由生活雄虫的睾丸,然后挑野生型雌虫与其交配,观察其后代表型。经过不断尝试虫体发育时期、注射部位和质粒浓度,发现虫体在体外23.5℃温箱发育40 h,注射部位在雄虫咽部下方,质粒浓度为900-1000 ng/ml时,可以观察到F1代L1表达GFP蛋白,虽然也是全身广泛表达以及在生殖原基处表达量较高,但是在虫体的头部和咽部表达量也较高。(3)CRISPR/Cas9系统在粪类圆线虫中应用本实验统计粪类圆线虫密码子使用情况,并分析了其使用密码子的偏好性,对Ce Cas9蛋白进行了优化,使其更好的在粪类圆线虫体内表达。在Wormbase上找到15个鼠类圆线虫(Strongyloides ratti)U6基因,多序列比对它们的蛋白序列,找到相对保守的位点,然后再往其上下游延伸,得到512 bp大小的序列作为g RNA的启动子。同时利用软件和文献报道的规律设计8条g RNA打靶于Ss-dpy-2第一个外显子。为了验证软件设计的8条g RNA是否具有良好的打靶效率,做了sp Cas9/g RNA体外酶切效率检测实验,发现gRNA4、7和8切割效率较高。为了验证经优化的Ss Cas9和g RNA是否都在粪类圆线虫发生转录,我们将p AJ50-Cas9质粒和p XL-BACII-gRNA4显微共注射到粪类圆线虫自由生活的雌虫性腺中。提取后代虫体的RNA进行反转录PCR扩增。发现扩增得到Ss Cas9和g RNA片段,说明Ss Cas9和g RNA完成了转录,也表明构建的质粒的启动子Ss-rps-21和Sr-U6具有催化转录活性。我们针对gRNA4、7和8这3个打靶位点,构建相应的同源修复模板。将p AJ50-Cas9分别与p XL-BACII-gRNA4、p XL-BACII-g RNA7和p XL-BACII-g RNA8及其相应的同源修复模板进行显微共注射,提取后代的基因组,进行巢式PCR扩增鉴定,凝胶电泳没有发现扩增条带。扩增Ss-dpy-2第一个外显子测序,没有杂峰现象,说明Ss-dpy-2没有发生突变,CRISPR/Cas9系统仍然需要进一步探究。本研究对长爪沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型进行了改进和优化,首次建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型。通过粪类圆线虫雄虫的生殖细胞实现转基因,并解析Ss-rps-21启动子通过雄虫生殖细胞进行转基因F1代的表达谱。初步尝试构建适用于粪类圆线虫的CRISPR/Cas9系统,验证了Ss-rps-21和Sr-U6启动子活性,为后续的粪类圆线虫CRISPR/Cas9基因敲除系统的建立奠定了坚实的基础。