五味子乙素对骨肉瘤细胞的抑制作用及其机制研究

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背景:骨肉瘤是全世界范围内最常见的骨恶性肿瘤,其预后不良与早期常伴有肺转移有关。五味子乙素(Schisandrin B,Sch B),来源于我国传统中草药五味子。利用现代药物成分提取技术从五味子中分离出的五味子乙素,其主要化学成分为活性二苯并碳二烯木质素。目的:本研究旨在评估Sch B是否能抑制骨肉瘤细胞的过度增殖、迁移和侵袭,并促进其凋亡,以及Sch B是否能在裸鼠体内抑制骨肉瘤细胞转移到裸鼠的肺部。于此同时深入探讨Sch B实现其抗骨肉瘤能力的相关的潜在机制。方法:我们通过结晶紫染色法、MTT比色法检测了Sch B对143B,MG63,SAOS2和U2OS等骨肉瘤细胞细胞增殖的影响。我们通过克隆形成实验检测了Sch B对143B骨肉瘤细胞的原始集落形成能力的影响。我们通过划痕愈合实验探究Sch B对143B和MG63骨肉瘤细胞的迁移能力的阻碍作用,并通过Transwell实验进一步验证,于此同时评估其对骨肉瘤细胞侵袭力的削弱能力。我们使用流式细胞术观察Sch B对143B和MG63骨肉瘤细胞周期的影响。我们通过Hoechst染色法和流式细胞术观察Sch B对143B和MG63骨肉瘤细胞凋亡的影响,以及观察Sch B作用下发生的细胞核形态学的变化情况。蛋白印迹法(Western blot)从分子层面水平研究蛋白的表达是否与先前细胞现象实验中的表现呈现一致性。我们通过网络药理学分析Sch B作用于143B骨肉瘤细胞的潜在的信号通路。并进一步通过细胞挽救实验分析Sch B对143B骨肉瘤细胞的药理作用与相关通路的联系。我们通过在裸鼠的胫骨平台处接种143B细胞,建立了基于免疫缺陷的裸鼠的骨肉瘤模型,以检测Sch B在体内对骨肉瘤生长转移的效果,完成动物造模及给药后,我们对瘤体和肺组织进行取材,完成固定后进行组化分析。最终探讨Sch B是否在构建的裸鼠骨肉瘤模型中抑制肿瘤生长,以及Sch B是否具有在裸鼠体内减少骨肉瘤突破原发部位的的能力。结果:结晶紫染色法表明Sch B降低了骨肉瘤细胞增殖能力。MTT染色法表明Sch B成正相关联降低了骨肉瘤细胞的活力并减少了其活细胞数量。克隆形成实验结果表明Sch B有抑制骨肉瘤起始的能力。Transwell迁移侵袭实验和划痕愈合实验表明Sch B能减弱骨肉瘤细胞的迁移和侵袭的能力。流式细胞术分析显示Sch B在G1期阻断细胞并以浓度正相关形式诱导骨肉瘤细胞凋亡。Hoechst 33258染色从形态学角度展示了Sch B作用下骨肉瘤细胞核所发生的核碎裂、核固缩和核溶解等变化。Western blot的结果发现,经Sch B治疗后,与上述细胞现象实验中相关的蛋白表达发生了与抗骨肉瘤效果正相关的改变。通过网络药理学分析和Western blot实验分析筛选发现Sch B抗骨肉瘤的潜在的分子机制。细胞挽救实验发现相关信号通路的关键靶点激活剂均可一定程度上逆转Sch B对骨肉瘤的治疗作用。以上几种实验结果相互印证,表明Sch B可能通过抑制双重信号通路包括Wnt/β-Catenin和PI3K/Akt发挥对骨肉瘤的治疗作用。在胫骨平台骨肉瘤裸鼠模型中,Sch B能在裸鼠体内中抑制肿瘤生长,并减少骨肉瘤突破原发部位进而导致肺转移的发生。结论:Sch B通过抑制双重信号通路发挥对骨肉瘤的治疗作用。尤其是Sch B还具有在裸鼠体内减少骨肉瘤远处转移的能力。研究结果提示Sch B可能成为临床上抑制骨肉瘤肺转移并抑制骨肉瘤生长的一种新型辅助治疗药物。
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