论文部分内容阅读
甜菜碱具有影响脂肪代谢的作用,可重新分配体内脂肪,但在不同物种间的表现形式和具体机制各不相同。本实验室前期研究发现,甜菜碱对朗德鹅肝脂代谢的影响极具特殊性:降低了高能碳水化合物填饲的朗德鹅的皮脂和腹脂重,却增加了鹅肥肝重。本研究以此为切入点,以朗德鹅原代肝细胞为研究材料,通过在WME完全培养基上添加不同浓度的葡萄糖诱导鹅肝细胞脂肪沉积,来模拟高能碳水化合物诱导的肥肝细胞,构建体外肥肝细胞模型。通过检测细胞活性、TG含量和油红O染色确定合适的葡萄糖诱导浓度。在合适的葡萄糖诱导浓度上添加不同浓度的甜菜碱,通过检测细胞活性、TG含量和油红O染色确定合适的甜菜碱处理浓度。然后在预实验的基础上,设立正常对照组,高浓度葡萄糖诱导组和甜菜碱处理组,比较了不同组不同时间段朗德鹅原代肝细胞脂质沉积和大小脂滴分布情况,通过试剂盒测定线粒体膜电位变化来推测脂肪酸在线粒体的β-氧化情况,用荧光定量方法检测脂质合成、分泌和转运等影响肥肝生成的主要途径的关键基因的表达水平,并用weston blot方法检测脂肪分化关键基因PPARγ和C/EBPβ的蛋白表达变化。鉴于C/EBPβ基因在转录和翻译水平均差异极显著,扩增出其完整的DNA序列,进行生物信息学和组织表达分析,并检测该基因核心启动子活性区和结构功能域的甲基化情况。主要结果如下: (1)用不同浓度葡萄糖诱导朗德鹅肝细胞后发现,浓度低于5mmol/L时,诱导组TG含量与对照组差异不显著,浓度在10-50mmol/L间的葡萄糖诱导时,诱导组TG含量显著高于对照组(P<0.05),浓度高于100mmol/L时肝细胞因沉积脂质过多而碎裂涨破,诱导组TG含量显著低于对照组(P<0.01)。葡萄糖浓度不大于50mmol/L时,细胞活性较为稳定,浓度高于100mmol/L时会超过细胞的耐受性,不利于细胞存活。最终确定20mmol/L为本试验最佳葡萄糖诱导浓度。 (2)在20mmol/L的最佳葡萄糖诱导浓度下添加不同浓度的甜菜碱共同培养鹅肝细胞,不同的甜菜碱处理浓度对肝细胞内脂质沉积的影响差异显著:甜菜碱浓度小于10mmol/L的处理组,细胞内总TG含量与以单独高浓度葡萄糖培养的诱导组细胞内总TG含量没有差异,甜菜碱浓度在20-30mmol/L的处理组可显著促进细胞内脂质沉积,总TG含量显著高于葡萄糖诱导组(P<0.05),当甜菜碱浓度高达50mmol/L时处理组细胞内脂质沉积受到抑制,TG含量显著降低(P<0.01)。最终确定20mmol/L为本试验最佳甜菜碱处理浓度。 同一组不同时间段TG沉积水平差异均极显著(P<0.01)。不同组不同时间段细胞内脂滴的数量和大小分布差异明显,三组内诱导组的大脂滴最大,数量最多,分布最不均匀;诱导组大脂滴数最少,小脂滴数最多,脂滴分布最均匀;对照组居于其它两组之间。 (3)比较不同组间不同时间段朗德鹅原代肝细胞脂质沉积和大小脂滴分布情况发现:各时间段诱导组和处理组的TG含量均高于对照组,差异极显著(P<0.01)。12h时,诱导组和处理组的TG含量差异不显著,24h和48h时处理组细胞内总TG含量均高于诱导组,且差异显著(P<0.05)。同一组不同时间段TG沉积水平差异均极显著(P<0.01)。不同组不同时间段细胞内脂滴的数量和大小分布差异明显,三组内诱导组的大脂滴最大,数量最多,分布最不均匀;处理组大脂滴数最少,小脂滴数最多,脂滴分布最均匀;对照组居于其它两组之间。 线粒体膜电位检测发现,诱导组的线粒体膜电位下降,甜菜碱恢复了处理组的线粒体膜电位,差异显著(P<0.05),处理组与对照组的线粒体膜电位差异不显著。甜菜碱降低脂肪合成通路关键基因FAS和SREBPc、脂肪沉积关键基因DGAT2、调控肝内脂代谢的关键基因LXRα和PPARα基因、脂肪分化基因C/EBPβ和PPARγ基因表达水平,升高脂肪酸水解及转运的关键基因MTP和LPL表达水平,与诱导组相比差异显著或极显著。甜菜碱抑制了C/EBPβ蛋白的表达(P<0.05),但没有改变PPARγ蛋白表达量。 (4)克隆获得朗德鹅C/EBPβDNA完整序列2075bp,包含984bp的开放阅读框及5’端部分序列。分析发现,鹅C/EBPβ基因无内含子,整个序列是一个长CpG岛。其蛋白序列与鸡和人的序列分别有96.66%和62.07%的相似性。理论等电点pI为8.696,被定位于胞核,无跨膜区,不合明显的疏水区,不存在信号肽,属于非分泌性蛋白。组织表达谱结果显示,该基因在鹅肝脏和脂肪组织中表达量较高。活体实验不同组间鹅肝中C/EBPβ的相对表达情况显示,甜菜碱抑制该基因的表达(P<0.05)。亚硫酸盐测序法检测不同组间C/EBPβ基因的甲基化情况发现,其启动子核心区54个CpG位点和结构功能域的28个CpG位点在不同组间差异均不显著。说明甜菜碱可能不是通过甲基化作用来影响C/EBPβ基因转录。