医院感染中革兰阴性菌约占60%-70%,是引起人类感染性疾病的主要病原之一。近年来全球各地细菌耐药监测数据表明,革兰阴性菌对临床常用抗菌药物耐药性日益严重,耐碳青霉烯类药物的肠杆菌科细菌、非发酵菌比例逐年升高,且对其他临床常用抗菌药物也呈现多重耐药,但是针对这部分“超级细菌”的抗菌药物研发明显落后,它所导致的感染治疗困难,病死率高,已成为医学界和公众都非常关注和担忧的问题。常规病原学诊断方法包括细菌培养、分离及药敏试验,所需时间长,难以及时指导感染性疾病的病原治疗。随着分子生物学与细菌基因组学的发展,快速、灵敏的核酸检测方法已开始用于病原学的快速诊断及某些耐药基因的检测。本课题在分析临床常见病原菌共有的23S rRNA基因及革兰阴性菌主要耐药基因的基础上,探索建立可用于检测多重耐药革兰阴性菌的快速基因诊断方法,并应用于临床,有望为耐药菌早期病原诊断、耐药性分析提供客观依据,从而及时、正确指导临床抗感染治疗方案的选择。预防重于治疗,医院感染中绝大部分患者系经过直接或间接接触感染,属于可控、可防的环节,切断传播途径有望减少医院感染的发病。因此对多重耐药革兰阴性菌导致的医院感染进行流行病学及临床研究可为控制耐药菌传播提供依据。本课题回顾性分析2005～2011年华山医院共6年期间血流感染、中枢神经系统感染患者的临床资料,总结院内不动杆菌感染的临床特点、菌株敏感性与预后关系。同时对2011年3月～2012年2月华山医院血液、脑脊液标本分离的革兰阴性菌进行超广谱p-内酰胺酶、碳青霉烯酶、甲基化酶筛查以明确上述耐药基因的流行情况。本课题共包括以下三个部分：第一部分多重耐药革兰阴性菌基因诊断方法的建立基因芯片技术是近几年来快速发展的分子生物学技术平台,因其具有快速、灵敏、特异、高通量、样本用量少等特点而被广泛应用于生物学研究的各个领域,在细菌菌种鉴定、耐药基因检测、基因突变及多态性、基因表达谱分析等方面均有不少探索性研究,但能否应用于临床常规检测仍有不少争议。基于细菌核糖体核糖核酸(rRNA)基因序列中保守区和多变区相互间隔排列的特点,利用基因序列保守区设计通用引物,利用多变区设计特异性探针,使基因芯片快速鉴定细菌菌种成为可能。国内外先后有应用16SrRNA和23S rRNA基因检测细菌的报道,但对于菌株的耐药性无法得到明确的结果,难以正确指导临床抗菌药物的选择。目前临床上多重耐药革兰阴性菌中对健康威胁最大的产碳青霉烯酶菌株,此外甲基化酶可导致菌株对氨基糖苷类高度耐药,给治疗带来极大困难。本课题在前期利用23S rRNA基因快速鉴定菌种的研究基础上,设计了KPC、NDM、VIM、IMP型及OXA23、OXA5、OXA58组碳青霉烯酶耐药基因、armA和rmtB型甲基化酶耐药基因的PCR引物和探针,将耐药性检测的多对引物整合于1个PCR反应中,然后将所有探针固定于同一张基因芯片上,通过PCR产物与基因芯片杂交,可一次性明确菌株产常见碳青霉烯酶、甲基化酶情况,期望建立起能同步完成病原及耐药谱检测的基因诊断方法。结果证实基因芯片用于检测NDM、 IMP、KPC、OXA23、OXA51、OXA58型碳青霉烯酶耐药基因,armA型甲基化酶耐药基因杂交信号满意,可重复性好。但检测VIM型碳青霉烯酶和rmtB型甲基化酶耐药基因杂交信号不明显,重复性差,仍需进一步优化探针设计。第二部分多重耐药革兰阴性菌基因诊断方法的临床研究血流感染是临床常见的重症感染性疾病之一,具有较高的发病率及病死率,近年来发病率有上升趋势。由耐药菌导致感染的患者预后与能否及早针对病原选用敏感抗菌药物治疗密切相关。为进一步评估基因芯片检测多重耐药革兰阴性菌耐药基因携带情况的诊断价值,本课题收集了2011年3月～2012年2月华山医院血培养机器报阳标本356份,对其中119株革兰阴性菌采用基因芯片进行碳青霉烯酶和甲基化酶耐药基因检测,结果与PCR方法进行比较。结果显示基因芯片方法检测KPC型、NDM型碳青霉烯酶耐药基因、armA型甲基化酶耐药基因与PCR方法的符合率为100%,检测OXA23型、OXA51型碳青霉烯酶耐药基因和rmtB型甲基化酶耐药基因与PCR方法的符合率分别为90.0%、80.0%和58.3%。基因芯片诊断方法所需时间约6-8小时,较常规纸片法药敏试验在鉴定时间上缩短16～18小时,若同步进行菌种鉴定及耐药基因检测,则较常规细菌培养+药敏试验缩短2天以上,有助于指导临床血流感染抗菌药物方案的选择。第三部分多重耐药革兰阴性菌医院感染的临床及分子流行病学研究肠杆菌科细菌和不动杆菌属是多重耐药革兰阴性菌医院感染的重要病原菌。本课题收集华山医院2005年1月～2011年12月共6年期间74例不动杆菌血流感染、90例中枢神经系统感染患者的临床资料进行回顾性分析,明确不动杆菌血流感染、中枢神经系统感染的临床特征、抗菌治疗与预后关系。结果表明不动杆菌血流感染、中枢神经系统感染几乎全为医院感染,多发生于术后及重症患者。不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素耐药率较低,患者预后与不动杆菌对抗菌药物的敏感性密切相关。此外为了解临床分离革兰阴性菌中常见耐药基因携带情况,本课题对2011年3月-2012年2月华山医院自血液、脑脊液分离获得的170株革兰阴性菌应用PCR方法进行KPC、NDM、VIM、IMP、GIM、SPM、 OXA23、OXA24、OXA58型碳青霉烯酶耐药基因,SHV、TEM、CTX-M型超广谱β-内酰胺酶耐药基因和armA、rmtB型甲基化酶耐药基因检测。结果显示：58株纸片法对碳青霉烯类抗菌药物不敏感革兰阴性菌中有77.6%(45/58)菌株携带碳青霉烯酶耐药基因。产KPC、OXA型碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制。86株细菌纸片法对氨基糖苷类药物不敏感菌株中有38.4%(33/86)菌株携带甲基化酶耐药基因,甲基化酶耐药基因也主要存在与肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌中。所有170株革兰阴性菌中PCR检测到产SHV菌株26株、产TEM菌株24株、产CTX-M菌株69株,在分离前三位革兰阴性菌中大肠埃希菌产ESBLs比例最高,为75.0%(27/36)。ERIC-PCR分析菌株同源性,23株产OXA型碳青霉烯酶耐药基因鲍曼不动杆菌可分为4个亚型。17株携带KPC型和4株携带NDM型碳青霉烯酶耐药基因的肺炎克雷伯菌、洛菲不动杆菌均可分为2个亚型,提示菌株存在同源性可能。