肾移植手术发展至今,已经使无数的终末期肾病患者的生存质量得到显著提高,生存时间得以延长,但肾移植术后排斥反应和感染会导致移植肾失功,甚至危及受者生命。目前学术界普遍认为,上述两种亟需攻克的难题与机体免疫功能失衡息息相关。随着免疫抑制治疗手段的不断进步,组织配型技术和外科手术技术的提高,移植排斥反应的发生率正在逐年降低。但是免疫抑制药物的使用也提高了肾移植受者机会性感染的风险,可以说免疫抑制药物的临床应用具有双面性,在保护移植器官免受宿主体内免疫系统攻击的同时也导致了机会性感染的发生。因此,移植术后如何对受者的免疫功能状态做出客观、准确的评价,是指导临床免疫抑制药物合理使用的基础,这样既可以使肾移植受者的免疫状态在免疫排斥和免疫耐受之间保持平衡,确保移植物在受者体内长期存活,又可以避免因免疫抑制剂过量应用带来的潜在风险,因此肾移植术后受者体内免疫功能的评价是当前器官移植领域关注的焦点之一。红细胞(RBC)是血液运送氧气的最主要的媒介,而近年来的研究发现,红细胞除了具有携氧功能之外,还具有免疫功能,是人体内数量最多的天然免疫细胞。既往的研究认为,成熟的无核红细胞似乎不具备参与机体免疫功能的遗传物质基础。直到1981年Siegel提出“红细胞免疫系统”的概念,学术界才认识到红细胞膜表面表达了许多免疫分子,这些免疫相关物质参与了黏附、识别、浓缩、杀伤抗原、清除循环免疫复合物(circulating immune complex, CIC)等过程。对肺炎球菌和梅毒螺旋体等进行体外实验中发现,在有补体和红细胞参与的情况下,白细胞的吞噬功能明显增强；也有研究报道红细胞可以阻止肿瘤细胞在体内的扩散,这些研究均提示红细胞虽然没有细胞核,但是仍然具有免疫调节功能。红细胞对于维持机体免疫系统的平衡和稳定发挥着至关重要的作用,在体内可以与淋巴细胞等免疫细胞相互作用,协同参与对免疫细胞网络的调控。红细胞参与对机体免疫反应的调控主要是通过其表达的膜表面免疫分子实现的,其中,补体受体-1(complement receptor 1, CR1/CD35)在红细胞免疫黏附功能中具有非常重要的作用,其与C3b具有较强的亲和力,可以结合并参与清除血浆中的循环物质,促进单核-巨噬细胞吞噬循环中的免疫复合物,并通过二次抗原递呈的作用间接参与调控细胞因子的产生。红细胞还可通过产生特异性TNF诱导因子、NK细胞增强因子等来参与机体非特异性免疫调控,及细胞因子的调控,尽管其分子机制尚未完全明确,但有研究证实红细胞可以通过其膜表面CD58、CD59等淋巴细胞CD2的天然配体分子促进与NK细胞和T细胞的结合,清除淋巴细胞微环境活性氧物质,提高NK细胞杀伤活性和T细胞抗凋亡能力,并促进淋巴细胞产生IL-1、IL-2等细胞因子。已有多种疾病的病程进展中存在红细胞膜表面分子表达异常,如肝炎、良恶性肿瘤、自身免疫性疾病、糖尿病等。慢性肾衰竭患者由于肾功能的损坏,促红细胞生成素分泌减少,容易导致贫血的发生。肾移植手术后,随着肾功能恢复,同时贫血状况也随之改善,但是在此过程中,红细胞膜表面免疫分子的表达变化以及红细胞免疫功能状态等尚未有相关研究。鉴于此,本研究就红细胞免疫分子在肾移植术后表达变化及其机制进行了分析探讨。首先,通过流式细胞术测定肾移植受者红细胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59的表达,旨在明确肾移植及其术后不同免疫状态下受者红细胞膜表面分子表达变化情况,从而更全面的评估肾移植受者的免疫状态,以期为临床免疫抑制治疗提供更好的依据。并利用Transwell和细胞联合培养等方法,观察体外条件下,不同免疫抑制剂对红细胞免疫分子表达的影响,以及红细胞与T、B淋巴细胞的相互作用,通过对培养过程中细胞因子表达情况的检测,对不同免疫状态的肾移植受者红细胞对T和B淋巴细胞增殖情况的影响机制进行研究,观察红细胞免疫功能肾移植术后不同免疫状态下的变化,以及红细胞在体外对淋巴细胞调节作用的机制。一、红细胞CD35/CD58/CD59在肾移植受者中的表达变化选择2013年1月至2014年6月间接受首次同种异体肾移植手术,术后移植肾功能稳定的受者50例为稳定组,慢性肾衰竭患者65例为慢性排斥反应慢性肾衰竭组(简称CRF组),以50例健康体检人员为对照组。同时,对52例肾移植受者进行组织病理学检查,选择肾移植术后发生移植肾功能延迟恢复的受者11例为移植肾功能延迟恢复组(简称DGF组),以及肾移植术后发生急性排斥反应的受者16例为急性排斥反应组(简称AR组),留取上述不良事件发生时的肾移植受者外周抗凝血样本。采用流式细胞术分别检测各组研究对象的外周血红细胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59的平均几何荧光强度(GMFI)表达,观察肾移植受者术后发生肾功能延迟恢复和排斥反应时外周血红细胞免疫分子CD35/CD58/CD59的变化,并与对照组和稳定组进行比较,来探讨红细胞免疫功能在受者肾移植后不同状态的表达情况。结果显示,CRF组CD35、CD58、CD59的GMFI表达分别为(25.26±7.92)、(89.94±13.8)、(75.38±16.49)明显低于对照组,P<0.05；稳定组CD35 (27.04 ±6.0)、CD59(87.62±20.90)的表达虽然较CRF组高,但明显低于对照组,P<0.05,稳定组CD59的表达明显高于CRF组,P<0.05；稳定组CD58的表达与对照组无明显差异,P>0.05。DGF组与AR组红细胞免疫分子CD35表达分别为(22.46±5.01)、(24.51±6.58),明显低于对照组,P<0.05,但与稳定期对照组差异无统计学意义；DGF组和AR组CD58表达分别为(73.24±11.11)、(77.42±16.60)明显低于对照组,P<0.05; DGF组和AR组红细胞免疫分子CD59表达分别为(58.66±15.82)、(77.17±28.49),明显低于对照组,P<0.05 AR组虽低于稳定组,但无统计学意义；DGF组CD59表达明显低于AR组,P<0.05。该结果提示,由于肾功能受损,CRF患者红细胞表达的免疫分子均有所下调,红细胞免疫功能受损,而肾移植术后随着肾功能恢复,红细胞表达的免疫分子有所恢复,但除CD58表达与正常对照无差别之外,CD35和CD59表达仍低于正常对照。在肾移植术后出现DGF时,体内出现过度的缺血再灌注损伤,对红细胞免疫分子表达影响明显,尤其是CD58和CD59,其表达低于稳定组和对照组,并且CD59甚至低于AR组,提示缺血再灌注损伤产生的大量活性氧自由基对红细胞表达免疫膜分子影响明显。而AR时,由于炎症的局限性,未能形成全身性的炎症反应,因此其表达变化较小。二、肾移植受者红细胞免疫功能与淋巴细胞亚群相关性及巨细胞病毒感染对红细胞CD35/CD58/CD59表达的影响对2013年1月至2014年6月间接受首次同种异体肾移植手术的受者术后血清肌酐恢复情况进行监测,选择30例肾移植术后功能稳定的受者为连续监测组,分别于术前1d、术后3d、7d、14d各个时间点采集连续监测组受者外周血样本；收集临床疑似病毒感染的肾移植受者外周血进行间接免疫荧光技术对其巨细胞病毒(CMV)早期抗原PP65检测,以发现1个或1个以上阳性细胞/2×105个白细胞,则定为阳性。选择外周血CMV-pp65抗原阳性的肾移植受者61例为CMV活动性感染组(简称CMV组),采用流式细胞术同时检测其外周血红细胞免疫分子CD35/CD58/CD59的表达和T、B、NK淋巴细胞的水平。研究发现,健康对照组红细胞CD35的表达与CD59表达呈正相关,与CD4+T细胞的百分比呈正相关,与B细胞的百分比呈负相关,差异均有统计学意义。肾移植受者术前1d、术后3d、7d、14d的红细胞免疫分子CD35GMFI表达分别为(27.00±7.5)、(28.04±7.2)、(25.70±6.83)和(24.19±6.0)均低于对照组,P<0.05。受者术前、术后3d、7d、14d的红细胞免疫分子CD59GMFI表达分别为(80.44±20.56)、(91.50±23.17)、(85.02±24.92)和(82.67±25.56)均低于对照组,P<0.05。受者红细胞免疫分子CD58GMFI表达与对照组比较,差异没有统计学意义。连续监测组术后3dCD3+T淋巴细胞绝对数(773.5±301)低于对照组,P<0.05；术后3d与术前1d(2288±723)相比明显降低,P<0.05； NK细胞绝对数在术后3d时降至最低(108.3±40.1),与对照组、术前1d、术后14d比较P<0.05；B细胞绝对数在术后7d(610.2±215.6)、14d(765.5±269.4)急剧增高,甚至高于术前和对照组,P<0.05。CMV组的红细胞免疫分子CD35/CD58/CD59表达明显低于对照组,P<0.05；非活动性感染组的CD59表达高于CMV组,P<0.05。其中高活动性感染组的红细胞CD35、CD59的表达均低于低活动感染组,P<0.05。三、红细胞对T、B淋巴细胞影响的初步探讨对2015年7月至2015年12月期间接受同种异体肾移植术后3个月内稳定期的受者,以及在B超引导下移植肾穿刺活检后病理结果提示发生排斥反应的受者,留取其外周抗凝血标本,用密度梯度离心法分离红细胞和单个核细胞(PBMC).分离后的红细胞加免疫抑制剂刺激48h与单独培养48h的膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59表达相比没有明显差异。将稳定期受者红细胞、排斥受者红细胞分别与健康人的PBMC联合培养后,采用流式细胞术对培养后的混合细胞中红细胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59的表达和T、B淋巴细胞的水平进行检测,发现稳定红细胞组B细胞比例较排斥组明显增高,并且CD19表达的明显上调,出现强阳性细胞群。通过用流式细胞术对该群细胞表型分析以及胞内标记IL-10,结果显示该细胞为分泌IL-10的CD19+的调节性B细胞亚群,提示稳定期受者红细胞可以增加外周血Breg细胞比例。为了明确红细胞与诱导Breg之间的关系,我们利用磁珠分选纯化B细胞和T细胞,发现单独与红细胞共培养的B细胞没有明显增殖,而加入T细胞共培养则Breg亚群增加,提示红细胞是通过T细胞诱导Breg产生和B细胞增殖的。为了对细胞之间相互调控的机制进行深入研究,我们利用Transwell小室,将红细胞与T细胞联合至于小室上层进行培养,同时在下室加入B细胞,结果发现B细胞出现增殖,Breg亚群比例增加,提示T细胞可能通过旁分泌的方式诱导Breg的产生；ELISA检测结果显示,稳定红细胞组和T细胞共培养后培养上清中的IL-10和TGF-β的含量高于排斥红细胞组。体外联合培养的结果提示,红细胞可以通过促进T细胞分泌IL-10和TGF-β来诱导B细胞增殖和Breg的产生。结论：慢性肾衰竭患者体内红细胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59表达降低,提示在慢性肾功能衰竭的尿毒症状态损害了红细胞免疫功能,移植后,肾功能随着肌酐的降低逐渐恢复,红细胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59表达有所上调,但除了CD58之外,CD35和CD59表达在肾功能恢复后其表达仍低于健康对照组,可能与免疫抑制剂的使用有关。肾移植手术后,红细胞免疫功能和淋巴细胞免疫功能均出现紊乱,在术后随着血清肌酐的降低、肾功能稳定后可逐渐恢复。肾移植术后发生DGF、急性排斥反应和巨细胞病毒感染时,受者红细胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59表达下调,提示这些不良事件过程伴随有红细胞免疫功能的变化,与疾病过程有关。免疫抑制剂西罗莫司、环孢素和他克莫司在短时间内并不影响循环中红细胞表面CD35/CD58/CD59分子的表达。稳定期受者红细胞可促进健康对照者PBMC中的B细胞增殖,且可诱导B细胞向调节性B细胞亚群分化,该过程是是通过促进T细胞活化分泌细胞因子来间接诱导B细胞增殖的。采用流式细胞术对红细胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59的表达进行检测,对于评估肾移植受者术后免疫状态,早期诊断、预防排斥反应、感染等不良反应的发生,以及指导合理用药有一定临床意义。