研究背景脑卒中（Ischemic stroke,IS）是最常见的脑血管疾病之一,其中缺血性脑卒中发病率最高,约占脑卒中总数的87%。缺血性脑卒中引发的神经元死亡、神经炎症反应和神经血管单元的破坏会导致严重的神经系统疾病。静脉溶栓是目前最重要的恢复患者脑血流的措施之一,但是时间窗较窄限制了其在临床的应用,而且再灌注以后可能会造成更严重的脑损伤,称为脑缺血/再灌注（Cerebral ischemia-reperfusion,I/R）损伤。大量临床和实验研究表明,脑缺血再灌注损伤会引发免疫和炎症紊乱,而炎症紊乱也会进一步加重脑缺血再灌注损伤,从而对患者的抢救和恢复产生不利影响。因此,及时阻断炎症反应能够减轻脑缺血再灌注带来的级联反应。中药具有疗效好、副作用小的特点,大量研究表明,中药能够极大地改善脑卒中患者的血液流变状态,减轻患者临床症状,降低患者死亡率。灯盏生脉胶囊（Dengzhan shengmai capsule,DZSM）是益气活血类中药的代表性方剂,由灯盏细辛、人参、麦冬和五味子组成,广泛应用于缺血性脑卒中、血管性痴呆和其他脑血管疾病的治疗。现代药理研究表明,灯盏生脉胶囊能够减轻脑缺血再灌注损伤引发的神经炎症,但是具体作用机制尚未完全阐明。因此,本课题首先对灯盏生脉胶囊干预脑缺血再灌注损伤的药效学进行评价;其次基于转录组测序对灯盏生脉胶囊干预脑缺血再灌注损伤的作用特点进行整体勾勒;最后基于单细胞转录组测序对神经炎症的效应细胞小胶质细胞作用特点进行研究,深入挖掘灯盏生脉胶囊干预脑缺血再灌注损伤小胶质细胞的关键靶标和作用途径,系统阐明灯盏生脉胶囊调控小胶质细胞神经炎症干预脑缺血再灌注损伤的作用机制,为灯盏生脉胶囊的临床应用提供基础研究证据。研究方法第一章灯盏生脉胶囊干预脑缺血再灌注损伤药效学评价及转录组分析1.采用大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）大鼠模型,探究灯盏生脉胶囊对脑缺血再灌注损伤的脑保护作用。将大鼠随机分为:假手术组（Sham）、模型组（I/R）、灯盏生脉胶囊低剂量组（I/R+DZSM-L,0.1134 g/kg）、灯盏生脉胶囊高剂量组（I/R+DZSM-H,0.4536 g/kg）和阳性药组（金纳多,I/R+Ginaton,20 mg/kg）。大鼠通过灌胃连续给药五天,于第五天给药后建立MCAO模型,脑缺血1.5 h,再灌注24 h。通过Longa5神经功能缺损评分、红四氮唑（Triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色、脑血流监测、苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,H＆E）染色以及尼氏染色评价灯盏生脉胶囊对MCAO大鼠的脑保护作用。2.采用转录组测序技术,探究灯盏生脉胶囊干预脑缺血再灌注损伤的作用特点。对Sham组、I/R组和I/R+DZSM-H组大鼠脑组织进行转录组测序及生物信息学分析,主要包括差异基因筛选、聚类分析和富集分析。第二章基于单细胞测序的灯盏生脉胶囊干预脑缺血再灌注损伤关键靶标的发现1.采用单细胞转录组测序技术,构建灯盏生脉胶囊干预脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织单细胞图谱。将Sham组、I/R组和I/R+DZSM-Ⅱ组大鼠脑组织提取细胞核后进行单细胞转录组测序及生物信息学分析,主要包括细胞注释、细胞占比分析、组间差异分析和富集分析等。2.采用单细胞转录组测序技术,发现灯盏生脉胶囊干预脑缺血再灌注损伤小胶质细胞的关键靶标。基于单细胞转录组测序结果,对小胶质细胞进行生物信息学分析,通过基因富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）、差异分析、聚类分析、富集分析、韦恩（Venn）分析发现灯盏生脉胶囊干预脑缺血再灌注损伤小胶质细胞的关键靶标。采用免疫荧光染色检测关键靶标在不同细胞类型中的定位及表达情况。第三章MALT1在脑缺血再灌注损伤中的作用1.采用MCAO大鼠模型和氧糖剥夺/复氧（Oxygen glucose deprivation/re-oxygenation,OGD/R）损伤类脑器官模型,探究MALT1在大鼠脑组织和类脑器官中的变化。通过建立脑缺血1.5 h,再灌注3 h、6 h、12 h、24 h不同时间点MCAO大鼠模型,采用蛋白质免疫印迹（Western blot）检测MALT1在大鼠脑组织中的变化情况。采用酶联免疫吸附测定法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测脑缺血再灌注损伤后炎症因子的变化情况,如IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10和ARG1。同时,建立缺氧缺糖8h和12 h,复氧24 h,不同时间点OGD/R损伤类脑器官模型,采用免疫荧光染色检测MALT1在类脑器官中的变化情况。2.采用MCAO大鼠模型,探究MALT1抑制剂（MI-2）对脑缺血再灌注损伤的脑保护作用。将大鼠随机分为:假手术组（Sham）、模型组（I/R）和MALT1抑制剂组（I/R+MI-2,10mg/kg）。大鼠通过腹腔注射连续给药五天,于第五天给药后建立MCAO模型,脑缺血1.5 h,再灌注24 h。通过Longa 5神经功能缺损评分、TTC染色、脑血流监测、H＆E染色以及尼氏染色评价MI-2对MCAO大鼠的脑保护作用。采用ELISA检测MI-2对MCAO大鼠脑组织炎症相关指标如IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10和ARG1表达的影响;采用western blot检测MI-2对MCAO大鼠脑组织MALT1、CYLD和CYLD-ct表达的影响。3.采用MCAO大鼠模型,探究si-MALT1对脑缺血再灌注损伤的脑保护作用。将大鼠随机分为对照组（si-NC,1 μg/μL）和MALTI敲减组（si-MALT1,1μg/μL）。分别于第一天和第三天通过脑室注射si-MALT1,并于第五天建立MCAO模型,脑缺血1.5 h,再灌注24 h。采用western blot筛选si-MALT1 有效片段,并检测 si-MALT1 对 MCAO 大鼠脑组织 CYLD 和 CYLD-ct表达的影响。通过Longa 5神经功能缺损评分、TTC染色、脑血流监测、H＆E染色以及尼氏染色评价si-MALT1对MCAO大鼠的脑保护作用;采用ELISA检测si-MALT1对MCAO大鼠脑组织炎症相关指标如IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10和ARG1表达的影响。4.采用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导的BV2小胶质细胞模型,探究MI-2对LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症反应的影响。将细胞分为正常对照组（Control）、模型组（LPS）和不同浓度MI-2给药组（0.01 μM、1μM、2μM）。采用免疫荧光染色检测MI-2对LPS诱导的BV2小胶质细胞MALT1表达的影响;采用ELISA检测MI-2对LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症相关指标如IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10 和ARG1 表达的影响。5.采用转录组测序技术,探究MALT1在脑缺血再灌注损伤中的作用机制。对si-NC组和si-MALT1组大鼠脑组织进行转录组测序,通过生物信息学分析如差异基因筛选、聚类分析、富集分析和MCODE分析,筛选关键通路并采用western blot检测si-MALT1对通路上关键蛋白表达的影响。第四章灯盏生脉胶囊及其有效成分对MALT1及神经炎症干预作用1.采用MCAO大鼠模型,探究灯盏生脉胶囊对MALT1及神经炎症的影响。将大鼠随机分为:假手术组（Sham）、模型组（I/R）、灯盏生脉胶囊低剂量组（I/R+DZSM-L,0.1134 g/kg）、灯盏生脉胶囊高剂量组（I/R+DZSM-H,0.4536 g/kg）和阳性药组（金纳多,I/R+Ginaton,20 mg/kg）。大鼠通过灌胃连续给药五天,于第五天给药后建立MCAO模型,脑缺血1.5 h,再灌注24 h。采用western blot检测灯盏生脉胶囊对MALT1表达的影响;采用ELISA检测灯盏生脉胶囊对MCAO大鼠血清炎症相关指标如IL-6、TNF-α和IL-1β表达的影响以及MCAO大鼠脑组织炎症相关指标如IL-6、IL-1β、TNF-α、ICAM-1、MMP9、IL-10和ARG1表达的影响;采用免疫荧光染色检测灯盏生脉胶囊对MCAO大鼠脑组织MMP9、ICAM-1和IBA-1表达的影响。2.采用LPS诱导的BV2小胶质细胞模型,探究灯盏生脉胶囊对MALT1及炎症的影响。将细胞分为正常对照组（Control）、模型组（LPS）和不同浓度灯盏生脉胶囊肠吸收液给药组（15.625 μg/mL、31.25 μg/mL、62.5 μg/mL）。采用免疫荧光染色检测灯盏生脉胶囊对LPS诱导的BV2小胶质细胞MALT1表达的影响;采用ELISA检测灯盏生脉胶囊对LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症相关指标如NO、IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10 和ARG1 表达的影响。3.采用LPS诱导的BV2小胶质细胞模型,探究野黄芩苷和绿原酸对MALT1及炎症的影响。将细胞分为正常对照组（Control）、模型组（LPS）、不同浓度野黄芩苷和绿原酸给药组（0.1 μM、1 μM、2 μM）。采用免疫荧光染色检测野黄芩苷和绿原酸对LPS诱导的BV2小胶质细胞MALT1表达的影响;采用ELISA检测野黄芩苷和绿原酸对LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症相关指标如NO、IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10 和ARG1 表达的影响。研究结果第一章灯盏生脉胶囊干预脑缺血再灌注损伤药效学评价及转录组分析1.灯盏生脉胶囊显著改善MCAO大鼠脑缺血再灌注损伤。与I/R组相比,灯盏生脉胶囊能够显著降低MCAO大鼠神经功能缺损评分和脑梗死面积;显著增加MCAO大鼠局部脑血流值;改善M大鼠脑组织病理损伤,显著增加MCAO大鼠皮层、海马CA1、CA3区神经元密度以及尼氏小体数量。2.炎症反应为灯盏生脉胶囊干预脑缺血再灌注损伤的关键生物学过程之一。转录组差异分析结果表明,与Sham组相比,I/R组共1483个差异基因;与I/R组相比,I/R+DZSM组共573个差异基因。此外,I/R+DZSM组的基因模式与Sham组更相似。富集分析结果表明,灯盏生脉胶囊干预后的差异基因显著富集到免疫反应、炎症反应、TNF信号通路、NF-kappa B信号通路等与炎症相关的生物学过程和信号通路上。第二章基于单细胞测序的灯盏生脉胶囊干预脑缺血再灌注损伤关键靶标的发现1.灯盏生脉胶囊干预脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织单细胞图谱构建。通过对单细胞转录组数据进行降维和聚类分析,在大鼠脑组织中鉴定出23个细胞亚群,通过标记基因鉴定到8种细胞类型,主要包括星形胶质细胞、内皮细胞、室管膜细胞、神经元、小胶质细胞、神经内分泌细胞、少突胶质细胞、少突胶质细胞前体。细胞占比和组间差异分析结果表明,小胶质细胞变化显著,小胶质细胞占比在脑缺血再灌注损伤后明显增加,而给药后降低。组间差异分析结果表明,I/R组小胶质细胞中有546个上调的差异基因,342个下调的差异基因,经灯盏生脉胶囊干预后有442个上调的差异基因,384个下调的差异基因。富集分析结果表明,小胶质细胞变化倍数排名前50的差异基因主要富集在“免疫反应”和“防御应答”。2.筛选出MALT1为灯盏生脉胶囊干预脑缺血再灌注损伤小胶质细胞的潜在关键靶标。I/R组基因GSEA分析结果表明,促炎相关的NF-κB信号通路（K004064）在I/R组上调。与Sham组相比,I/R组共888个差异基因;与I/R组相比,I/R+DZSM组共826个差异基因。富集分析结果表明,灯盏生脉胶囊干预后小胶质细胞中的差异基因显著富集到炎症反应和免疫反应等生物学过程。Venn分析结果表明,I/R组上调的差异基因和I/R+DZSM组下调的差异基因共141个交集基因,对I/R+DZSM组下调倍数排名前50的差异基因进行分析,筛选到MALT1可能为灯盏生脉胶囊干预脑缺血再灌注损伤小胶质细胞的关键靶标。单细胞转录组测序结果表明,I/R组小胶质细胞中MALT1的表达水平显著升高,灯盏生脉胶囊干预后小胶质细胞中MALT1的表达水平显著降低,在其他细胞类型各组比较中无统计学意义。免疫荧光染色结果表明,I/R组小胶质细胞中MALTI的表达水平显著升高,I/R+DZSM组小胶质细胞中MALT1的表达水平显著降低,但是在神经元和星形胶质细胞组间比较中无统计学意义。第三章MALT1在脑缺血再灌注损伤中的作用1.MALT1在MCAO大鼠和OGD/R损伤类脑器官中均呈现随着时间延长持续高表达的趋势。Western blot结果表明,与Sham组相比,MALT1在脑缺血1.5 h,再灌注3h、6h、12h、24h表达水平均显著升高,且MALT1呈现随着再灌注时间延长持续高表达的趋势。此外,ELISA结果表明,脑缺血1.5 h,再灌注24 h,大鼠脑组织中IL-6、TNF-α和IL-1β的表达水平显著升高,IL-10和ARG1的表达水平显著降低。免疫荧光染色结果表明,与Control组相比,MALT1在缺氧缺糖8 h和12 h,复氧24 h表达水平均显著升高,且MALT1随着缺氧缺糖时间延长表达增加。2.MI-2显著改善MCAO大鼠脑缺血再灌注损伤,并减轻神经炎症。MI-2能够显著降低MCAO大鼠神经功能缺损评分和脑梗死面积;显著增加MCAO大鼠局部脑血流值;改善MCAO大鼠脑组织病理损伤,显著增加MCAO大鼠皮层、海马CA1、CA3区神经元密度以及MCAO大鼠皮层和海马CA1区尼氏小体数量。此外,ELISA结果表明,MI-2能够显著降低大鼠脑组织中IL-6、TNF-α和IL-1β的表达水平,显著增加IL-10和ARG1的表达水平。此外,western blot结果表明,与I/R组相比,MI-2能够显著降低MCAO大鼠脑组织中MALT1和CYLD-Ct的表达水平,同时能够显著增加CYLD的表达水平,证明MI-2通过改变MALT1的表达量和蛋白酶活性发挥脑保护作用。3.MI-2显著降低LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症反应。免疫荧光染色结果表明,与LPS组相比,MI-2能够显著降低BV2小胶质细胞MALT1的表达水平。此外,ELISA结果表明,MI-2能够显著降低细胞上清中NO、IL-6、TNF-α和IL-1β的表达水平,显著增加IL-10、ARG1的表达水平,显著减轻LPS诱导的BV2小胶质炎症反应。4.si-MALT1显著改善脑缺血再灌注损伤,并减轻神经炎症。Western blot结果表明,与si-NC组相比,si-MALT1能够显著降低MCAO大鼠脑组织MALT1和CYLD-ct的表达水平,同时能够显著增加CYLD的表达水平。此外,si-MALT1能够显著降低MCAO大鼠神经功能缺损评分和脑梗死面积;显著增加MCAO大鼠皮层、海马CA1、CA3区神经元密度以及尼氏小体数量。此外,ELISA结果表明,si-MALT1能够显著降低MCAO大鼠脑组织中IL-6、TNF-α和IL-1β的表达水平,显著增加IL-10和ARG1的表达水平。5.si-MALT1能够抑制MCAO大鼠NF-κB信号通路。转录组测序结果表明,与si-NC组相比,si-MALT1组共1033个差异基因。富集分析结果表明,si-MALT1 干预后的差异基因显著富集到免疫反应、炎症反应、NF-kappa B 信号通路和TNF信号通路等与炎症相关的生物学过程和信号通路上。MCODE分析结果表明,共识别到24个模块,将排名第一的模块确定为候选主要模块,即模块1,该模块富集分析结果表明,上调的差异基因显著富集到趋化因子产生的调控等生物学过程;下调的差异基因显著富集到免疫反应和炎症反应等生物学过程。KEGG富集分析结果表明,差异基因显著富集到NF-kappa B信号通路和TNF信号通路等信号通路。结合前期单细胞转录组数据GSEA富集分析结果,NF-κB信号通路在I/R组上调,转录组数据再次证实该通路的重要性。Western blot结果表明,与si-NC组相比,si-MALT1组大鼠脑组织RELB和IKB-α的表达水平显著升高,且p-p65/p65的表达水平显著降低。第四章灯盏生脉胶囊及其有效成分对MALT1及神经炎症干预作用1.灯盏生脉胶囊显著降低MCAO大鼠脑组织MALT1的表达水平,并抑制神经炎症。Western blot和免疫荧光染色结果表明,与I/R组相比,灯盏生脉胶囊能够显著降低MCAO大鼠脑组织MALT1的表达水平,同时,ELISA结果表明,灯盏生脉胶囊能够显著降低MCAO大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的表达水平以及脑组织中IL-1β、TNF-α、ICAM-1、IBA-1和MMP9的表达水平,显著增加IL-10和ARG1的表达水平。2.灯盏生脉胶囊显著降低LPS诱导的BV2小胶质细胞MALT1的表达水平,并抑制炎症反应。免疫荧光染色结果表明,与LPS组相比,灯盏生脉胶囊能够显著降低BV2小胶质细胞MALT1的表达水平。此外,ELISA结果表明,灯盏生脉胶囊能够显著降低细胞上清中NO、IL-6、TNF-α和IL-1β的表达水平,同时能够显著增加IL-10和ARG1的表达水平,显著减轻LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症反应。3.绿原酸和野黄芩苷显著降低LPS诱导的BV2小胶质细胞MALT1的表达水平,并抑制炎症反应。免疫荧光染色结果表明,与LPS组相比,绿原酸和野黄芩苷能够显著降低BV2小胶质细胞MALT1的表达水平。此外,ELISA结果表明,绿原酸和野黄芩苷能够显著降低细胞上清中NO、IL-6、TNF-α和IL-1β的表达水平,同时能够显著增加IL-10和ARG1的表达水平,显著减轻LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症反应。结论1.灯盏生脉胶囊对MCAO大鼠具有显著的脑保护作用,炎症反应为灯盏生脉胶囊干预脑缺血再灌注损伤的关键生物学过程之一。2.MALT1可能是调控小胶质细胞激活介导神经炎症发生的关键靶标。此外,抑制或敲减MALT1的表达能够显著减轻脑缺血再灌注损伤及其诱导的神经炎症,且能够抑制NF-1κB信号通路。3.灯盏生脉胶囊可能通过抑制MALT1的表达发挥减轻脑缺血再灌注损伤及其诱导的神经炎症作用,野黄芩苷和绿原酸可能是灯盏生脉胶囊发挥干预脑缺血再灌注后神经炎症的主要有效成分。创新点1.本研究在单细胞测序的基础上,发现了干预脑缺血再灌注损伤小胶质细胞的关键靶标-MALT1,为脑缺血再灌注损伤的防治提供新的靶点和策略。2.本研究基于整体药效评价,结合组织病理学改变,深入研究效应细胞变化,筛选关键靶标调控的信号通路,解析灯盏生脉胶囊干预脑缺血再灌注损伤的作用机制,发现灯盏生脉胶囊可能通过抑制MALT1的表达发挥减轻脑缺血再灌注损伤及其诱导的神经炎症作用,为灯盏生脉胶囊的临床应用提供基础研究证据。