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研究背景:乳腺癌是常见的恶性肿瘤之一,全球发病率在近年来持续增长。乳腺癌在中国位于女性恶性肿瘤发病率的首位。乳腺癌按照分子表达,可分为Luminal A型、Luminal B型、HER2阳性型、基底样型(三阴性)。其中,三阴性乳腺癌恶性程度高,易发生远处转移,且由于化疗耐药和缺乏有效治疗靶点,患者预后差,临床治疗存在许多困难。Nek9属于蛋白激酶家族,定位于中心体和纺锤丝周围,在G2/M期过渡中发挥重要作用,并且通过磷酸化下游分子Nek6/Nek7调控微丝微管形成,从而参与纺锤体形成和中心体分离。课题组在前期研究中发现,在乳腺癌中Nek9的表达显著下降乃至缺失,并且表达缺失与突变型p53显著相关,进一步的体外和体内实验也证实,Nek9在三阴性乳腺癌中抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移。研究目的:1.明确Nek9失表达乳腺癌可能的Nek9基因改变。2.深入研究Nek9异常表达在乳腺癌发生发展中的作用机制。3.阐明乳腺癌中TP53和Nek9之间是否存在相互作用。研究方法:1.收集三阴性乳腺癌和正常乳腺的新鲜组织,通过免疫组织化学方法筛选得到Nek9阴性和Nek9阳性的病例,通过全外显子测序,检测在蛋白失表达病例中,Nek9可能存在的基因改变。2.使用诺考达唑同步化处理乳腺癌MCF-7细胞,然后进行免疫细胞荧光染色,在共聚焦显微镜下观察中心体和纺锤丝改变。3.采用CCK8实验检测同时干扰或过表达Nek9和TP53基因后,对乳腺癌细胞增殖的影响。4.通过Western Blot检测乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中Nek9和p53的蛋白表达水平。5.使用RT-qPCR和Western Blot检测在MCF-7和MDA-MB-231细胞中干扰TP53后对Nek9的影响。6.在MCF-7和MDA-MB-231细胞中通过Western Blot检测干扰p21后对Nek9表达水平的影响。7.在MCF-7和MDA-MB-231细胞中通过免疫细胞荧光染色,观察干扰或过表达p21后对Nek9和下游蛋白Eg5表达的影响。8.通过免疫共沉淀试实验,验证p21和Nek9之间是否存在结合。研究结果:1.全外显子测序发现,单核苷酸变异数据显示在外显子区的2个非同义突变,均为非特异突变。插入和缺失数据显示Nek9的三个内含子域存在缺失。GO与KEGG富集分析显示Nek9失表达的乳腺癌多条通路发生改变,其中包括肌动蛋白结合和细胞黏附通路。2.在MCF-7细胞中,共聚焦显微镜观察到干扰Nek9导致具有对称规则纺锤丝的中期细胞数明显减少(p=0.0335),中心体单个或全部缺失,纺锤丝紊乱并失去极性。3.在MCF-7和MDA-MB-231细胞中,MCF-7细胞表达野生型p53,而MDA-MB-231细胞表达突变型p53。MCF-7细胞中p21和Nek9的蛋白水平明显高于MDA-MB-231细胞。4.CCK8实验中显示,同时干扰Nek9和TP53促进MCF-7细胞增殖(p<0.0001),而干扰单一基因与对照组比较无显著统计学差异(siNek9组p=0.2099,siTP53组p=0.9012)。MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞中,同时过表达Nek9和TP53抑制细胞增殖(p=0.023,p=0.0005),且抑制效率显著高于单独过表达TP53(p=0.0065,p=0.0125),单独过表达Nek9与对照组无统计学差异(p=0.4783,p=0.6135)。5.在MCF-7细胞中干扰TP53,72小时后,Nek9蛋白水平出现明显下调。但在mRNA水平上干扰TP53后,Nek9的表达水平升高。6.在MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞中,干扰Nek9后,转染TP53,可部分恢复Nek9的蛋白表达。在过表达Nek9的MCF-7细胞中,封闭TP53能降低Nek9表达。7.干扰MCF-7细胞中p21基因,下调Nek9和Eg5表达;反之过表达p21,升高Nek9和Eg5;在MDA-MB-231细胞中,过表达p21,上调Nek9和Eg5表达。细胞免疫荧光实验具有相同趋势。8.免疫共沉淀实验结果显示p21与Nek9之间存在相互结合。研究结论:1.在Nek9失表达的乳腺癌中未查到Nek9特征性基因改变,其表达下降可能与Nek9存在杂合性缺失以及存在转录及翻译后修饰有关。2.在乳腺癌中,Nek9下调可导致纺锤体形成和中心体分离异常。3.乳腺癌中,p53通过p21调控Nek9表达,并与Nek9发挥协同抑癌作用。