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子痫前期(preeclampsia, PE)是人类妊娠期常见的一种多系统疾病,发生率约2%～8%,严重威胁着母婴健康,是导致孕产妇和胎儿围产期死亡的主要产科并发症。临床特征为妊娠20周以后出现高血压(BP>140/90mmHg)及蛋白尿(尿蛋白≥0.3g/24h或随机尿蛋白阳性)。几十年来,妇产界许多研究者长期致力于该病的研究,但至今子痫前期的病因和发病机制尚未阐明。除终止妊娠之外缺乏有效的临床治疗方法,始终是引起孕产妇死亡的主要原因之一。因此,该病一直是产科领域研究的热点。临床发现子痫前期在胎盘娩出后临床症状逐渐消失,因此胎盘成为子痫前期发病的关键,胎盘学研究成为子痫前期病因学研究焦点。滋养细胞(cytotrophoblast, CT)是胎盘组织中主要的细胞类型,与母体接触最为紧密,它的分化、迁移、侵入异常直接导致胎盘形成缺陷,与子痫前期的发病密切相关。子痫前期胎盘病理特点之一为合体滋养细胞(syncytiotrophoblast,ST)层发育不良。Sha等首次于2000年报道,人内源性逆转录缺陷病毒(human endogeneous retrovirus, HERV)家族一员HERV-W的包膜蛋白syncytin在胎盘组织高度表达。Syncytin的功能有介导体内胎盘滋养细胞的生长分化,促进细胞融合,抗凋亡和免疫抑制等。Syncytin-1是一个功能性融合蛋白可以介导滋养细胞融合成合体滋养细胞,这种多核的合体滋养细胞层是营养交换的场所,还可以分泌人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,HCG)f人绒毛膜促乳素(human chorionic somatomammotropin,HCS),对于维持正常的胎盘功能非常重要。Syncytin表达减少会导致细胞滋养细胞融合与分化异常,合体滋养细胞形成减少,血管功能紊乱和绒毛缺氧,可能是子痫前期的病因之一除了传统的研究,人们逐渐认识并越来越重视表观遗传学在PE发病中的作用。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式,在DNA甲基转移酶DNAmethyltransferases,DNMTs)的作用下,将CpG二核苷酸的胞嘧啶(C)甲基化为5-甲基化胞嘧啶(5-mC)的一种化学反应。DNA甲基化的作用包括调控基因表达、基因印记、维持基因组和染色体结构的稳定性等。Syncytin甲基化在子痫前期胎盘的状态国内外报道较少,DNMT3L与syncytin甲基化的关系国内外未见报道。本研究采用实时定量PCR,免疫组化,Western blot方法检测子痫前期胎盘组织syncytin-1mRNA及蛋白表达,甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP),,结合亚硫酸氢盐限制分析法(combined bisulfite restriction analysis, COBRA),测序技术检测(?)syncytin-1启动子区甲基化状态。探讨syncytin-1在子痫前期中的发病机制以及其甲基化与基因表达的关系,为PE的诊断病情监测治疗提供依据。第一部分子痫前期胎盘syncytin-1甲基化状态目的：分析子痫前期胎盘组织中syncytin-1的表达情况,syncytin-1甲基化状态及其与基因表达的关系,探讨子痫前期的发病机制。方法：1.实时定量PCR法检测syncytin-1, ASCT2, HCS, GCMa, DNA甲基转移酶1(DNMT1),DNA甲基转移酶3a(DNMT3a), DNA甲基转移酶3b(DNMT3b),DNA甲基转移酶3L (DNMT3L)在正常第三期(3N)和子痫前期(3P)胎盘组织mRNA水平；2.免疫组化法检测syncytin-1, HCS, DNMT1, DNMT3b, DNMT3L,5-甲基胞嘧啶(5-Methylcytidine,5mC)在子痫前期和正常胎盘组织蛋白定位表达情况；Western blot法检测syncytin-1在子痫前期和正常胎盘组织蛋白表达情况；3.采用甲基化特异性PCR (methylation specific PCR,MSP),结合亚硫酸氢盐限制分析法(combined bisulfite restriction analysis,COBRA)和重亚硫酸氧盐测序方法,检测子痫前期胎盘和正常胎盘组织syncytin-1启动子区5-LTRs(?)甲基化状态。结果：1.以GAPDH为内参照基因,与正常第三孕期(3N)相比,子痫前期(3P)胎盘组织中(?)DNMT3a, DNMT3b, syncytin-1和HCS mRNA表达水平降低(P<0.05), DNMT1,, DNMT3L mRNA表达水平升高(P<0.05); GCMa,ASCT2两组比较无显著性差异(P>0.05)；PCNA为内参照基因,与3N相比,3P胎盘组织中DNMT1, DNMT3b, DNMT3L mRNA表达水平升高,DNMT3a mRNA表达水平降低(P<0.05)。2.与3N相比,3P胎盘组织中syncytin-1和HCS蛋白表达较弱,DNMT3b, DNMT3L蛋白表达较强,而DNMT1,5mC染色结果两组无显著差异；Westernblot分析显示,syncytin-1在3N胎盘组织中强表达,在3P胎盘中弱表达；3. MSP, COBRA和测序结果均显示,与3N相比,3P胎盘组织中syncytin-1启动子区5’-LTRs甲基化水平升高(P<0.05);4. Spearman相关性分析,syncytin-1与DNMT3b mRNA水平负相关(r=-0.544,P<0.05); Syncytin-1与HCS mRNA水平正相关(r=0.713,P<0.01); Syncytin-1mRNA水平与其甲基化水平呈负相关(r=-0.505, P<0.05); DNMT3b与syncytin-1甲基化水平呈正相关(r=0.451,P<0.05); DNMT3L与syncytin-1甲基化水平呈正相关(r=0.536,P<0.05); DNMT3b与DNMT3LmRNA水平正相关(r=0.554,P<0.05);三种常用的甲基化检测方法中,MSP和COBRA (r=0.443,P<0.05), COBRA和测序(r=0.862, PO.01)结果呈正相关。结论：1Syncytin-1表达降低与子痫前期发病密切相关,但其受体ASCT2与子痫前期发病无关；2.在子痫前期syncytin-1异常升高的甲基化模式参与了子痫前期的发病,机制可能是syncytin-1启动子区高甲基化抑制了其基因的表达；3. DNMTs参与了syncytin-1甲基化的调节,以PCNA为内参照基因排除细胞增殖因素后,DNMT3L和DNMT3b在子痫前期高表达并都与syncytin-1甲基化水平呈显著正相关,DNMT3L与DNMT3b协同作用促进syncytin-1启动子区CpG的甲基化,从而抑制了syncytin-1基因的表达。第二部分Syncytin-1在非小细胞肺癌组织的初步研究研究背景肿瘤的发生与胎盘形成、生长发育过程有很多的相似之处,如增殖速率高、细胞生长缺乏接触抑制、具有迁移性和侵袭性、拥有丰富的血管网及血供等,而且在免疫上都能逃避免疫系统的攻击等。在世界范围内的多数国家及地区,肺癌发病率居各类恶性肿瘤的首位。在我国,肺癌已高居所有肿瘤发病率和死亡率首位,成为发病率和死亡率增长最快且严重危害人类健康和生命的恶性肿瘤,临床常用的治疗手段仍为手术、化疗和放疗。由于其发病率较高,但治疗效果有限,故5年生存率较低。如何提高肺癌患者5年生存率?哪些因素与肺癌患者的生存与预后密切相关?这些问题成了众多科学家研究的焦点。Syncytin-1与肿瘤预后的相关性研究国内外报道较少,与非小细胞肺癌预后的相关性国内外未见报道。为了研究肿瘤微环境免疫分子对肺癌患者生存和预后的影响,首先我们通过随访确定于术满5年的肺癌患者是否存活,然后对其病理组织进行免疫组化染色,进一步分析syncytin-1,T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域分子(T-cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule, TIM)3和CD4+、CD8+T细胞亚群与非小细胞肺癌患者5年生存率的关系,为寻找提高非小细胞肺癌患者5年生存率的有效办法和探索合理的治疗途径提供实验依据。目的：检测非小细胞肺癌组织syncytin-1,TIM-3,CD4+,CD8+T细胞表达情况,探讨免疫分子在非小细胞肺癌微环境分布及其预后价值。方法：免疫组化法检测syncytin-1, TIM-3, CD4+和CD8+T细胞在非小细胞肺癌组织表达,分析5年存活组和5年内死亡组表达差异。结果：Syncytin-1,TIM-3,CD4+T,CD8+T细胞在非小细胞肺癌组织都有表达；与5年存活组相比,5年内死亡组syncytin-1和TIM-3表达高,而CD8+T细胞阳性率表达低,差异有显著意义(P<0.05),CD4+T细胞表达两组差异无显著意义(P>0.05)。结论：Syncytin-1, TIM-3, CD8+T细胞在非小细胞肺癌组织表达,可作为判断预后的指标,CD8+T细胞表达高预后好,而syncytin-1,TIM-3表达高则预后不良。