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S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)是一种氨基酸衍生物,在生物体内与抗病性相关,是对相关病理障碍进行早期诊断的重要指标。外源SAH有镇静剂作用,是有效的安眠药和抗惊厥药物,同时也是一种抗病毒因子。随着SAH在医学领域的广泛研究与应用,其高效生产制备技术也成为近年国内外研究的热点课题。本文将来源于极端嗜热菌属海栖热袍杆菌Thermotoga maritima MSB8编码的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的结构基因sahase和乳酸脱氢酶的结构基因ldh分别与新型热激质粒pHsh连接,得到重组质粒pHsh-sahase, pHsh-ldh。将重组质粒pHsh-sahase, pHsh-ldh分别转入到大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)-RIL和BL21(DE3)中进行表达,得到了极耐热性S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHase)和极耐热性乳酸脱氢酶(LDH)。对重组菌(pHsh-sahase)产生的重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶进行纯化,经过热处理、Ni离子亲和柱层析两步纯化得到电泳纯级的蛋白,并对纯酶的酶学性质进行了分析。对重组菌(pHsh-ldh)产生的重组乳酸脱氢酶进行纯化,经过热处理、DEAE-Sepharose FF阴离子柱两步纯化得到电泳纯级的蛋白,并对纯酶的酶学性质进行了分析。对Tm-SAHase的酶学性质研究发现,该酶是一种NAD依赖型酶,在反应过程中需要要消耗大量NAD。在1 mM NAD 下,该酶的最适反应温度为85℃,最适反应pH为8.5,90℃酶活半衰期为1.5 h。在8 mM NAD下,该酶的最适反应温度高于100℃,最适pH为112。在工业生产常用温度60℃下,该酶能够长时间保持稳定,并具有较高的酶活力。SDS-PAGE结果显示该重组酶的分子量为45 kD,与理论值相符。对Tm-LDH的酶学性质研究发现,该酶的最适反应温度为95℃,最适pH 7.0；纯酶在90-C的半衰期为2 h,在pH 5.5-8.0之间最稳定；SDS-PAGE结果显示分子量为33 kD,与理论推算值相吻合。以丙酮酸和NADH为底物时,相对于丙酮酸的Km值1.7 mmol/L, Vmax为3.8×1 04U/mg；相对于NADH的Km值7.2mmol/L, Vmax值为1.1×105U/mg。Tm-LDH基因在T7载体中未能实现高效表达,但是在热激载体pHsh中得到了可溶性超量表达,表达水平达到340 mg/L。该酶在65℃反应条件下,活性达到最高活性的50%,并能保持活性不变,这使该酶能够与常温酶匹配,在辅酶NAD再生体系的建立中具有广泛的用途。本研究首次采用重组极耐热性Tm-SAHase进行SAH的酶法生产,在最适的生产条件下,0.5 mg的Tm-SAHase可催化合成24 μmol SAH。为了减少SAH生产过程中辅酶NAD的需求量,同时使Tm-SAHase维持较高的酶活性和稳定性,我们使用海栖热袍菌来源的重组极耐热性LDH与Tm-SAHase配伍,构建辅酶NAD再生系统,使SAH的产量在相同生产条件下较单酶系统提高了6倍。因此,海栖热袍菌来源的极耐热性SAHase和LDH能够形成稳定高效的辅酶循环体系,快速易行地生产SAH,此法在SAH批量制备或工业生产中具有巨大的应用价值。