鼠伤寒沙门菌(Salmonella enterica Serovar Typhimurium)是人兽共患病原菌,其多重耐药(Multidrug resistance,MDR)问题已成为危害世界公共卫生的难题。CpxAR系统是革兰氏阴性菌中普遍存在的一种双组分信号转导系统(Two component signal transduction system,TCS),它被证实在多种细菌耐药性形成的过程中发挥着重要作用。已有研究证实CpxAR可调控大肠杆菌对β-内酰胺类药物的耐药性,也可调控鼠伤寒沙门菌对头孢曲松的耐药性,但其对鼠伤寒沙门菌MDR的调控作用尤其是其调控机制还未被阐明。为了探索CpxAR系统对鼠伤寒沙门菌MDR的调控作用,并进一步阐明其调控机制,本研究进行了以下几个方面的试验:(一)首先运用基于Red同源重组技术的一步法失活染色体基因的方法,构建了鼠伤寒沙门菌标准菌株(JS株)cpxR基因缺失株(JS△cpxR)。然后,通过构建重组表达质粒pBAD-CpxR,并将其电转入缺失株JS△cpxR中构建回补菌株(JS△cpxR/pcpxR)进行回补试验,同时构建cpxR基因磷酸化位点突变互补株(JS△cpxR/pcpxR~*)作为对照。最后,采用CLSI推荐的微量肉汤稀释法测定了15种抗菌药物土霉素(OXY)、多西环素(DOX)、庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、安普霉素(APR)、新霉素(NEO)、痢菌净(MEQ)、喹乙醇(OLA)、环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、头孢曲松(CRO)、头孢噻呋(CEF)、头孢喹肟(CEQ)和粘菌素(COL)对菌株JS、JS△cpxR、JS△cpxR/pcpxR和JS△cpxR/pcpxR~*的最小抑菌浓度(MIC)。结果发现,氨基糖苷类的GEN、AMK、APR、NEO和β-内酰胺类的CEF、CRO、CEQ对亲本株JS的MIC值均为其对缺失株JS△cpxR MIC值的2~4倍;回补试验显示,随诱导剂L-阿拉伯糖浓度的增高,这7种抗生素对回补菌株JS△cpxR/pcpxR的MIC值均逐渐恢复到亲本株JS的水平,呈剂量依赖性关系,但上述7种药物对JS△cpxR/pcpxR~*的MIC值均未恢复。这表明,cpxR能够影响鼠伤寒沙门菌对GEN、AMK、APR、NEO、CRO、CEF和CEQ的敏感性。(二)利用上述同样的方法,构建acrB基因缺失株JS△acrB。然后以前期构建的菌株JS△cpxR::kan(cpxR被kan~r替代)为供体菌,以本试验中构建的acrB基因缺失株JS△acrB为受体菌,在P22噬菌体的转导作用下构建双基因缺失菌株JS△acrB△cpxR,同时制备cpxR基因回补菌株JS△acrB△cpxR/pcpxR和磷酸化位点突变回补株JS△acrB△cpxR/pcpxR~*。最后同样用微量稀释法测定上述15种抗菌药物对本试验中所有菌株的MIC值。结果显示,acrB基因缺失后,DOX、GEN、AMK、ENR、FFC、CRO、CEF和CEQ的MIC值分别降低为原来的1/32、1/4、1/4、1/4、1/16、1/32、1/4、1/2、1/128和1/4;双基因缺失后,其中5种抗菌药物(DOX、GEN、AMK、APR、CEF)的MIC值又进一步降低为原来的1/2~1/8倍;将双基因缺失菌株JS△acrB△cpxR的cpxR基因回补后,在0.2%的L-阿拉伯糖诱导下8种抗菌药物(DOX、GEN、AMK、APR、NEO、CRO、CEF和CEQ)的MIC值分别升高了4、16、2、4、4、2、4和4倍(如表2-3),但cpxR~*回补后未出现同样的现象。结果表明,在acrB缺失的情况下,cpxR可影响鼠伤寒沙门菌对β-内酰胺类和氨基糖苷类药物以及多西环素和粘菌素的敏感性,AcrB的存在可掩盖cpxR对鼠伤寒沙门菌MDR的部分调控作用。另外,将cpxR基因回补到菌株JS△acrB△cpxR中后,COL的MIC值降低为原来的1/32,说明在双基因缺失菌株JS△acrB△cpxR中将cpxR过表达,还可提高菌株对COL的敏感性。(三)运用Real-Time PCR的方法分析cpxR基因缺失和回补前后MDR相关基因(外膜蛋白基因ompF、ompC、ompD、ompW、stm1530和stm3031,外排泵基因acrB、acrD、acrF、mdtA和tolC,多重耐药调控基因marA和soxS)mRNA相对表达量的差异。结果显示,JS△cpxR与亲本株JS相比,所有检测基因的表达量均无显著差异;而回补菌株JS△cpxR/pcpxR经0.2%L-阿拉伯糖诱导后,与JS△cpxR相比,其外膜蛋白基因ompF、ompC、ompD和ompW的mRNA相对表达水平均显著降低,外膜蛋白基因stm1530和stm3031的mRNA表达水平均显著升高,外排泵基因acrB,tolC和调控基因marA和soxS的mRNA表达水平显著降低。另外,外排泵基因acrD和mdtA在JS、JS△cpxR和互补菌株JS△cpxR/pcpxR的mRNA表达水平均较低,且三株菌中几乎均未检测到外排泵基因acrF的表达。结果表明,CpxR的过表达可下调外膜蛋白OmpF、OmpC、OmpD、OmpW,外排泵AcrB、TolC和调控蛋白MarA、SoxS的表达量,上调外膜蛋白STM1530和STM3031的表达量。将菌株JS、JS△cpxR、JS△cpxR/pcpxR、JS△acrB△cpxR和JS△acrB△cpxR/pcpxR同时在亚MIC GEN诱导下传代至第15代得到五株诱导菌TS1、TS2、TS3、TS4和TS5,然后分析上述多重耐药泵基因的相对mRNA表达水平。结果发现,GEN诱导后,三个菌株中acrD和mdtA基因的mRNA表达水平均高于诱导前的菌株;而且在诱导菌中,TS3经0.2%L-阿拉伯糖诱导后acrD和mdtA的相对mRNA表达水平显著高于TS2,但诱导菌TS1、TS2、TS3、TS4和TS5中acrF基因的Real Time PCR扩增结果仍为阴性。结果表明,亚MIC GEN诱导下,CpxR可上调acrD和mdtA的表达量,对acrF的表达量无影响。(四)从127株来自不同地区(郑州、许昌、焦作、开封、新乡等)鸡场的沙门菌中,用多重PCR的方法鉴定出27株鼠伤寒沙门菌。从27株鼠伤寒沙门菌中挑选出9株对卡那霉素相对敏感的菌株,命名为SH1-9。利用噬菌体转导技术,以前期试验中构建的菌株JS△cpxR::kan(cpxR被kan~r替代)为供体菌,本试验中的9株鼠伤寒沙门菌临床分离株为受体菌,构建了9株分离菌的cpxR缺失株(SH1-9△cpxR),测定这些菌株在cpxR基因缺失前后的MIC值变化和MDR相关基因表达量的变化。结果发现,所有菌株在缺失cpxR基因后对AMK、GEN、APR、CEF的敏感性均有升高,其中有6株菌在缺失cpxR基因后对CRO的敏感性升高,有6株在缺失cpxR基因后对CEQ的敏感性升高,有3株在缺失cpxR基因后对DOX的敏感性升高,而所有菌株在缺失cpxR基因后对COL和FFC的敏感性均未见明显变化,结果表明cpxR对鼠伤寒沙门菌临床分离菌的氨基糖苷类和β-内酰胺类药物的耐药性亦具有调控作用;另外,9株临床分离菌在缺失cpxR基因后,有6株菌的ompF相对表达量显著上升,有5株菌ompC的相对表达量显著上升,有3株菌的ompD相对表达量显著上升,有4株菌ompW的相对表达量显著上升;仅有1株菌的stm1530相对表达量显著显著下降,有2株菌的stm3031相对表达量显著显著下降,有5株菌的acrD相对表达量显著显著下降,有6株菌的mdtA相对表达量显著显著下降,这一结果表明,在鼠伤寒沙门菌临床分离株中,cpxR基因的缺失可导致外膜蛋白OmpF、OmpC、OmpD、OmpW的表达量上升,外排泵AcrD和MdtA的表达量下降,而对外膜蛋白STM1530和STM3031表达量的影响不明显。(五)通过测定无抗生素和亚MIC GEN下,鼠伤寒沙门菌标准株(JS)、过表达株(JS/pcpxR)、磷酸化位点突变过表达株(JS/pcpxR~*)分别在不同能量水平的两种基本培养基中的生长曲线,结果显示,JS、JS/pcpxR和JS/pcpxR~*在M9-0.2%甘油(+亚MIC GEN)培养基中的对数生长期生长速率均低于各自在M9-0.2%甘油培养基中的对数生长期生长速率,JS和JS/pcpxR~*在M9-0.2%葡萄糖(+亚MIC GEN)培养基中的对数生长期生长速率也低于各自在M9-0.2%葡萄糖培养基中的对数生长期生长速率,但JS/pcpxR在M9-0.2%葡萄糖(+亚MIC GEN)培养基与在M9-0.2%葡萄糖培养基中的生长速率基本一致。结果表明,在葡萄糖提供高能量的环境下,CpxR的过表达可提高鼠伤寒沙门菌对GEN的抗性。通过分析靶基因启动子序列,发现在ompF、ompC、ompD和acrD基因的启动子区均存在CpxR box相同或相似序列。采用LacZ报告基因融合试验方法,构建ompD和acrD基因启动子的融合报告菌株并分析报告菌株的β-半乳糖苷酶活性,来分析CpxR对ompD和acrD基因启动子活性的影响,结果发现,无抗生素诱导和亚MIC GEN诱导下,报告菌株JS△cpxR/pcpxR/PompD的β-半乳糖苷酶活性均低于JS△cpxR/PompD,而仅在亚MIC GEN诱导下报告菌株JS△cpxR/pcpxR/PompD的β-半乳糖苷酶活性均高于JS△cpxR/PacrD。结果表明,CpxR可抑制ompD基因的启动子活性,增强acrD基因的启动子活性,且CpxR对外排泵AcrD转录的促进是其发挥对GEN耐药性调控作用的重要机制。综上所述,双组分调控子CpxR介导鼠伤寒沙门菌MDR的形成,主要包括氨基糖苷类、β-内酰胺类以及多西环素等药物耐药性的形成;CpxR对MDR相关基因(外膜蛋白基因ompF、ompC、ompD、ompW、stm1530和stm3031,外排泵基因acrD、mdtA和调控基因marA、soxS)表达水平的影响与其调控的上述抗生素耐药性的形成密切相关,其中CpxR对外排泵AcrD表达量的上调作用是其调控鼠伤寒沙门菌对氨基糖苷类药物耐药性的重要机制。