疼痛不仅仅被认为是一种症状,更被看作是一种疾病。近年来,慢性痛的发生率逐年增高,越来越多的人遭受着慢性痛的折磨,生活质量和身心健康都受到了严重的危害,痛不欲生。并且慢性痛发病周期长,难以治愈,更使得患者对于慢性痛的治疗会产生巨大的花费。长期遭受慢性痛还会使患者产生抑郁、恐惧及焦虑等不良情绪,严重危及患者的社交活动和人际关系。对于慢性痛的研究虽逐步深入,但是慢性痛的治疗仍不容乐观,临床上的镇痛药还存在很多局限性且特异性不强。因此免除疼痛是患者的权利,而研究疼痛的发生发展机制,研发新型的镇痛良药,解除疼痛则是我们每一个疼痛研究者的职责和目标。背根节(Dorsal root ganglion,DRG)神经元在传递和加工伤害性信息的过程中作为痛觉信息传导通路中的第一站,起着非常重要的作用,成为产生慢性痛信号的“起搏点”和“源头”;持续不断的慢性痛信号经过脊髓背角浅层进一步向中枢神经元传递诱发中枢敏化,造成痛觉过敏和触诱发痛,进而导致临床上常见又难以有效治愈的慢性痛。近年来,越来越多的实验结果表明瞬时感受器电位(Transient receptor potential,TRP)通道在痛觉信息的传递过程中响应细胞及机体内外的伤害性冷、热、机械和化学等刺激,将其转换为动作电位向脊髓及上位脑中枢传递并最终产生痛感觉。然而由于特异性工具药的缺乏,对经典的瞬时感受器电位(TRPC)通道的研究远远落后于其他的TRP通道。近年来,TRPC通道,尤其是TRPC3和TRPC6通道亚型在中枢神经系统的定位分布和参与调节神经生长、发育、认知、运动协调等功能逐渐被揭示。不仅在中枢神经系统中发现该通道的表达,TRPC3和TRPC6通道还大量地表达在痛觉信息传导路上,尤其是痛觉传导路的第一站DRG的中、小型神经元(因其主要负责伤害性信息的感受和传递又被称为伤害性感受神经元或伤害性感受器)。但是TRPC3和TRPC6通道负责响应机体内外的何种刺激以及在痛觉信息的传递过程中起着什么样的作用目前仍是悬而未决。在其他系统中的研究表明TRPC3和TRPC6在结构和功能上具有很大程度的冗余性(redundancy),通常形成功能性的同源或异源四聚体通道,而且其中一个基因的缺失会导致另一个基因代偿性地上调并代偿其功能。因此,为了确切阐明TRPC3和TRPC6通道在痛觉信息传递和敏化过程中的功能作用,我们从海德堡大学引进了TRPC3/TRPC6双基因敲除(TRPC3 and TRPC6 double knockout,TRPC3/6 DKO)小鼠模型,据此实现同时剔除TRPC3/TRPC6通道的结构和功能,以期揭示TRPC3和TRPC6通道在痛觉信息传递和痛敏形成过程中的功能意义,为研发针对TRPC3和TRPC6通道的新型镇痛药提供重要的科学依据和理论指导。第一部分:探讨TRPC3和TRPC6通道在正常生理状态下感受外周感觉信息的作用及病理情况下的致痛敏作用目的:观察TRPC3和TRPC6通道在正常生理状态下感受外周感觉信息的作用及病理情况下的致痛敏作用。方法:在正常生理状态下检测TRPC3/6 DKO小鼠与野生型小鼠对机械刺激以及热刺激反应性的差别。小鼠一侧后肢足底皮下注射完全弗氏佐剂(CFA)建立慢性炎性病理性疼痛模型,检测造模前和造模后不同时间点TRPC3/6 DKO小鼠与野生型小鼠对机械刺激和热刺激反应性的差别。一侧后肢足底注射炎性介质缓激肽,检测其诱发的自发痛行为反应在两种基因型动物之间的差别。采用转轴实验来验证TRPC3/6基因敲除后是否会影响小鼠的运动协调能力。结果:正常生理状态下,对成年雄性小鼠进行机械痛阈和热痛阈的检测,结果发现敲除小鼠对机械性刺激和热刺激的反应性较野生型小鼠显著下降。向小鼠后肢足底皮下注入完全弗氏佐剂(CFA)建立慢性炎性痛模型。实验结果显示野生型小鼠后肢足底皮下注入CFA后呈现显著的机械性痛敏和热痛敏现象,表现为注射足对机械刺激的反应阈值明显降低和对热刺激的反应潜伏期显著缩短。与野生型小鼠相比,TRPC3/6 DKO小鼠在CFA注射后诱致的机械性痛敏和热痛敏程度均显著减弱。这一结果提示TRPC3/6通道在CFA诱致的炎性痛过敏产生过程中发挥着重要作用。大量研究结果显示炎症或损伤发生时,受损部位的细胞释放多种炎症介质如缓激肽(Bradykinin)、组胺(Histamine)、前列腺素(PGE2)、P物质(Substance P),降钙素基因相关肽(CGRP)等,其与伤害性感受器上的相应受体作用最终导致伤害性感受器的阈值降低、反应性增强,该过程被称为“外周敏化(Peripheral sensitization)”。Bradykinin是损伤、炎症、缺血后局部组织和细胞释放的致痛作用最强的内源性炎性介质,局部注入Bradykinin可以诱致动物出现急性的自发痛反应和长时程的机械和热痛觉过敏现象。我们进一步检测TRPC3/6通道在组织损伤状态下的致痛敏作用是否是由于局部释放炎性介质Bradykinin介导的。为此,我们进一步观察TRPC3/6通道在内源性炎性介质Bradykinin诱致的痛觉反应中的作用。实验结果发现野生型小鼠后肢足底皮下注入Bradykinin可诱致显著的自发痛行为反应,表现为抬足、添足、咬足等痛行为反应。定量分析显示与野生型小鼠相比(83.14±8.26s),TRPC3/6 DKO小鼠的自发痛反应时间显著缩短(44.88±11.3 s)。以上结果强烈提示TRPC3和TRPC6通道可能在病理状态下协同发挥着显著的致痛敏作用。为了进一步验证TRPC3/6通道在上述痛行为中的作用是由于对感觉功能的特异性作用,我们进一步检测了TRPC3/6通道对小鼠运动协调能力的影响。转棒疲劳试验结果显示基因敲除小鼠与野生型小鼠从转轴掉落的时间没有显著差异,提示TRPC3/6通道对小鼠的运动协调能力没有显著影响。第二部分:TRPC3和TRPC6通道对DRG伤害性感受神经元兴奋性的影响目的:探讨TRPC3和TRPC6通道对DRG伤害性感受器兴奋性的影响。方法:取正常健康成年小鼠,在正常状态下以及建立CFA慢性炎性痛模型24 h后,采用全细胞膜片钳记录技术比较野生型小鼠和敲除小鼠L4-L5 DRG伤害性感受神经元被动膜特性和主动膜特性之间的差异。结果:1)我们取正常健康成年小鼠,采用全细胞膜片钳记录技术在正常生理状态下比较野生型小鼠和敲除小鼠L4-L5 DRG伤害性感受神经元被动膜特性和主动膜特性之间的差异。结果显示在正常生理情况下,野生型小鼠和敲除小鼠的被动膜特性如静息膜电位(RMP)、膜电阻(Rm)和膜电容(Cm)均无显著性差异。通过向DRG神经元内注入去极化电流诱致动作电位检测主动膜特性时发现,TRPC3/6基因敲除小鼠诱致动作电位(action potential,AP)产生所需的基强度(Rheobase)显著高于野生型小鼠。同时,注入相同强度的去极化电流诱致AP的发放频率也较野生型小鼠显著降低。这一结果提示TRPC3和TRPC6通道在决定生理状态下DRG伤害性感受神经元的兴奋性中发挥着重要的作用。2)同样采用全细胞膜片钳记录技术在CFA诱致后24h的病理情况下对野生型小鼠和敲除小鼠L4-L5 DRG伤害性感受神经元被动膜特性和主动膜特性进行记录。结果发现在CFA诱致的炎性病理痛状态下,野生型小鼠在CFA后与正常状态下比较兴奋性显著升高,具体表现在DRG神经元诱致AP的基强度与正常状态下相比(88.57±24.73 p A),CFA注射后基强度显著减小(30±8.7 p A)。DRG神经元AP的频率与正常状态下相比(11.81±3.17 Hz),CFA注射后显著增强(34.49±2.68 Hz)。而敲除小鼠与野生型小鼠相比,兴奋性显著低于野生型小鼠。上述结果提示TRPC3和TRPC6通道在决定病理状态下的DRG伤害性感受神经元的超兴奋状态中发挥着关键作用。第三部分:TRPC3和TRPC6通道对炎性痛情况下脊髓背角c-Fos与p-ERK表达的影响目的:进一步探讨TRPC3和TRPC6通道发挥的致痛敏作用是否是通过增强脊髓背角痛觉神经元的反应性来实现的。方法:小鼠后肢足底皮下注射福尔马林,2 h后灌注、取小鼠腰膨大脊髓、后固定、脱水、行冰冻切片,片厚30mm,采用免疫组化进行染色。结果:实验结果显示福尔马林诱致的脊髓背角浅层c-Fos与p-ERK的表达上调在TRPC3/6 DKO小鼠被显著削弱。以上结果提示TRPC3和TRPC6通道在炎性痛情况下对脊髓背角浅层神经元活动具有显著的增强作用。第四部分:TRPC3和TRPC6通道敲除后对脊髓背角I层神经元兴奋性突触传递和突触可塑性的影响目的:进一步明确TRPC3和TRPC6通道发挥致痛敏作用的细胞和分子机制。方法:采用生后15-21 d的小鼠,在正常状态下以及建立CFA慢性炎性痛模型24 h后,制作脊髓薄片标本,对脊髓背角I层的神经元进行全细胞膜片钳记录。观察基因敲除小鼠和野生型小鼠脊髓背角I层神经元兴奋性的差异以及TRPC3/6通道对伤害性初级传入突触传递效能及可塑性改变的影响。记录脊髓背角I层神经元的被动和主动膜特性;记录刺激伤害性初级传入纤维在脊髓背角I层神经元诱发的兴奋性突触后电流(e EPSCs),以及脊髓背角I层神经元自发兴奋性突触后电流(s EPSCs)。结果:1)在正常生理状态下,采用不同刺激强度(100mA,300mA,500mA,1m A,2m A,3m A)刺激初级传入纤维后根进入区记录在脊髓背角I层神经元诱发的e EPSCs。绘制刺激-反应曲线(input-output curve,I-O曲线)发现随着刺激强度的增大,e EPSCs的幅度也随之增大。比较e EPSCs的I-O曲线发现,TRPC3/6 DKO小鼠的I-O曲线呈现明显右移和下移,即敲除小鼠e EPSCs的幅值明显低于野生型小鼠。这一结果提示TRPC3/6通道在脊髓背角的正常兴奋性突触传递中发挥重要作用。2)CFA注射后,野生型小鼠e EPSCs的幅值与正常状态下相比呈现显著增强,表现为I-O曲线较正常状态的I-O曲线明显左移和上移,这一结果提示炎症损伤状态下,脊髓背角初级传入突触传递发生了显著的可塑性改变。与野生型小鼠相比,TRPC3/6 DKO小鼠在CFA注射后e EPSCs的可塑性改变被明显减弱。3)我们同时还对炎症病理情况下TRPC3/6通道对自发突触传递的作用进行了观察。经对野生型小鼠和敲除小鼠s EPSCs的频率和幅值进行比较,结果显示TRPC3和TRPC6通道敲除后s EPSCs的频率被显著地抑制,而幅度没有显著改变。这一结果提示TRPC3和TRPC6通道对炎症损伤情况下脊髓背角I层神经元自发的兴奋性突触传递具有显著的增强效应。4)为了进一步揭示TRPC3和TRPC6通道对兴奋性突触传递和可塑性改变的作用是突触前机制还是突触后机制介导的,我们对炎症情况下e EPSCs的PPR(paired-pulse ratio)进行分析,结果显示TRPC3/6基因敲除后e EPSCs的PPF(paired-pulse faciliation)和PPD(paired-pulse depression)均发生了显著性改变,该结果提示TRPC3和TRPC6通道可能是通过增强初级传入纤维终末突触前递质的释放机率来介导其对兴奋性突触传递和可塑性的影响,进而发挥致痛敏作用。结论:1.我们利用基因敲除小鼠这一工具,全面揭示了TRPC3和TRPC6通道可能在协同感受外周的机械性和热刺激方面发挥着重要作用。首次明确提出TRPC3和TRPC6通道在慢性病理性痛中可能发挥致痛敏作用。2.首次揭示TRPC3和TRPC6可能通过增强外周敏化介导致痛敏作用的细胞分子机制。炎症或损伤后,外周敏化被认为是介导慢性痛发生发展的重要神经机制。TRPC3和TRPC6通道在正常状态下DRG伤害性感受神经元的兴奋性以及炎症损伤诱致的超兴奋状态中发挥关键作用。3.首次揭示TRPC3和TRPC6进一步通过增强初级传入突触传递及可塑性改变介导致痛敏作用的细胞分子机制。炎症或损伤后,外周敏化和初级传入突触可塑性改变均被认为是介导慢性痛发生发展的重要神经机制。TRPC3和TRPC6通道敲除后显著抑制脊髓背角I层神经元的e EPSCs及其可塑性增强。PPR和s EPSCs的进一步分析揭示TRPC3和TRPC6通道可能是通过增强初级传入纤维终末突触前递质的释放机率来介导其对兴奋性突触传递和可塑性的影响,进而发挥致痛敏作用的。