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间充质干细胞来源于胚胎早期发育中胚层,是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞,在体外可以分化诱导为骨、脂肪、神经等多种组织细胞。具有向受损组织归巢并且修复、重建受损或病变的组织器官的特点,此外应用间充质干细胞做为细胞治疗的手段时由于其具备低免疫原性的特点,可降低免疫排斥反应,提高移植成活率,使其成为当前成体干细胞研究的热点。人脐带结缔组织是间充质干细胞的丰富来源,相对于骨髓来源的间充质干细胞破坏侵入性分离过程而言,脐带间充质干细胞更加易于获得,并对母子均无损伤,使其成为细胞治疗中的理想细胞而逐渐替代骨髓来源间充质干细胞。因此如何快速,高效地从脐带中分离、储存间充质干细胞而满足基础与临床研究的需要成为尤为重要的问题。本研究工作主要包括两部分内容。第一部分是应用组织块贴壁法分离、培养人脐带间充质干细胞,观察采集脐带后不同处理时间、以及脐带冻存复苏后脐带间充质干细胞分离成功率、生长增殖情况等,探讨组织块贴壁分离法用于间充质干细胞大规模生产扩增的可行性。实验采用DF12培养基对2-3mm3大小的人脐带组织块进行贴壁培养,观察不同处理时段的脐带组织原代细胞获得时间、细胞得率等情况。结果表明,24小时以内处理的组织细胞分离成功率100%(6/6),得到原代细胞的平均时间17.33±0.84天,平均得到4.03±0.97×104个细胞/cm；24-48小时组的分离成功率为92%(11/12),得到原代细胞的平均时间为为22.00±1.72天,平均可获得1.22±0.24×104个细胞/cm；48-72小时组的分离成功率降至87%(13/15),平均获得原代细胞的时间为21.69±2.15天,平均获得1.01±0.22×104个细胞/cm。液氮储存复苏组分离成功率为100%(10/10),得到原代细胞的平均时间为20.60±2.13天,平均可获得2.08±0.30×104个细胞/cm。结果表明,随着脐带组织处理时间延长,分离成功率下降,平均每厘米脐带组织获得原代细胞数量降低,脐带组织块冻存复苏后可以获得人脐带间充质干细胞。第二部分是探讨表皮生长因子(EGF)和成纤维样生长因子(bFGF)能否促进原代间充质干细胞的贴壁能力,以及对传代细胞免疫表型、细胞周期及诱导分化能力的影响。实验应用胶原酶消化法对人脐带间充质干细胞进行分离,观察EGF和bFGF对原代细胞贴壁生长增殖情况、以及对第4代细胞免疫表型、细胞周期及诱导分化能力的影响。结果表明,完全培养基组促贴壁时间平均为51.42±4.38小时,bFGF组为38.37±2.96小时,EGF组为32.25±1.85小时,bFGF+EGF组为33.61±1.56小时。培养至第7天时,bFGF组、EGF组、EGF+bFGF组细胞数量分别为细胞培养组的3倍、4倍和3.5倍,均有统计学意义。传至第4代时各组细胞的HLA-I类分子、间充质干细胞表面常见分子CD105、CD73均表达为阳性；而HLA-II类分子及造血干细胞表面分子CD34、白细胞表面共同抗原CD45均表达为阴性。细胞周期分析显示：细胞培养基组S期细胞为13.87%,bFGF组、EGF组EGF+bFGF组S期细胞比例分别为28.22%、23.61%、28.22%,略高于细胞培养基组。EGF组、bFGF组、EGF+bFGF组均可以成功向成骨和成脂方向诱导。综上所述,组织块贴壁分离法可以获得原代贴壁的间充质干细胞,但处理时间对组织块贴壁分离法的成功率有影响。生长因子EGF、bFGF可促进人脐带间充质干细胞早期贴壁和细胞增殖,但是否促分化还有待进一步研究。