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桑黄菌(Phellinus igniarius)是珍稀的药用真菌,具有独特的药用价值和广泛的生物活性,多糖是桑黄菌的最主要的活性成分。本文利用物理诱变手段筛选了高产桑黄菌菌株,对桑黄菌菌丝体胞内多糖的理化性质、组成结构、生物活性、多糖的固体外貌形态等进行了考察,利用蛋白质二维电泳技术对诱变机制进行了探索,考察了超声波对桑黄菌液体发酵的促进作用并对其作用机理进行了初探。主要研究工作及结论如下:(1)原生质体制备条件的优化。经过优化,获得最佳的桑黄菌菌丝体原生质体的制备条件为:桑黄菌菌丝体的菌龄为10d,用酶解反应体系为1%的溶壁酶和0.25%的崩溃酶进行酶解,酶解温度为30℃、酶解时间为3h。(2)桑黄菌诱变方式的选择及其诱变。将低能量He-Ne激光与紫外复合诱变与紫外诱变的正诱变率进行比较,结果显示低能量He-Ne激光与紫外复合诱变的正诱变率是单纯紫外诱变的2倍多。利用低能量He-Ne激光与紫外复合诱变方式诱变桑黄菌原生质体,经过五代筛选获得9株优势菌株,其中菌株JZx生产能力最佳并且遗传性状稳定。经摇瓶发酵,JZx的菌丝干重是CK(对照)的1.40倍,菌丝胞内多糖产量是CK的1.57倍。(3)优势诱变突变体的鉴定。利用拮抗实验和同工酶分析对激光与紫外复合诱变筛选获得的优势菌株进行突变体鉴定,结果显示优势菌株的遗传物质发生改变。同工酶酶谱结果暗示了激光与紫外复合诱变这种新颖的诱变方法可以产生较宽的突变范围。(4)突变菌株JZx与出发菌株CK的菌丝体胞内多糖理化性质、分子结构和生物活性的比较。JZx与CK相比,菌丝体胞内多糖包含较高的总糖含量和糖醛酸含量;这两种多糖的单糖基本都由L-鼠李糖,D-葡萄糖和少量的D-甘露糖组成,但是这三种单糖的在组成中所占比例不尽相同,CK为9:1:3而JZx为2:1:16;分子量分布结果显示突变菌株JZx菌丝体胞内多糖与对照相比包含有更多的低重均分子量糖片段(1.5 kDa,61%)。红外光谱结果暗示了激光与紫外复合诱变可能引起了糖苷键的断裂但是总体上没有影响多糖的主要化学结构。羟自由基清除实验表明:JZx菌丝体胞内多糖与CK相比表现为较强的羟自由基清除能力。TEAC试验和FRAP实验结果显示JZx菌丝体胞内多糖有最大的 TEAC 值 195.43μmol Trolox/g 和 FRAP 值 20.57μmol Fe2+/g,与CK相比分别高出32.44%和22.8%,具有更强的抗氧化能力。MTT法测定多糖体外抗人肝癌细胞HepG2的活性,结果显示与CK相比JZx菌丝体胞内多糖对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制效果更加明显。(5)JZx与CK的菌丝体胞内多糖的固态形貌比较。利用扫描电镜(SEM)对CK和JZx菌丝体胞内多糖的固态形貌进行考察,结果显示JZx菌丝体胞内多糖与CK的胞内多糖的外观形态相比较发生了改变,多糖聚合物的片状结构较小且网孔孔径也较小。(6)JZx菌丝体胞内多糖的分离纯化。利用DEAE-52—Sepharose Fast Flow离子柱层析对JZx菌丝体胞内多糖分离提纯,获得两个多糖组分,分别为PIPS1和PIPS2。PIPS1和PIPS2蛋白质和糖醛酸的含量很少,多糖含量均在99%左右;PIPS1和PIPS2主要由D-葡萄糖、L-鼠李糖组成,还含有少量的D-甘露糖,PIPS1的单糖的分子摩尔比例:L-鼠李糖:D-葡萄糖:D-甘露糖=4:9:1,PIPS2的单糖的分子摩尔比例:L-鼠李糖:D-葡萄糖:D-甘露糖=3:7:1;PIPS1与PIPS2相比包含有大量的低分子量糖片段(3.1KDa,93%)。(7)诱变机理的研究。以JZx和CK菌丝体总蛋白为研究对象,利用蛋白质二维电泳以及二级质谱鉴定获得20个差异蛋白。经过生物信息学分析,推测有4个蛋白与糖代谢相关;3个蛋白可能参与细胞的大分子物质的合成;2个蛋白为分子伴侣;1个蛋白参与芽孢萌发。这个结果暗示了激光和紫外这种外界因素的胁迫诱导桑黄菌细胞代谢发生了变化,并且细胞发生了应激反应诱导分子伴侣和参与芽孢萌发的蛋白高表达。(8)超声波辅助桑黄菌液态发酵。为了提高桑黄菌菌丝体发酵胞内多糖的产量,利用平板超声这种新颖的技术促进发酵过程的进行。以桑黄菌菌丝体发酵胞内多糖的产量为指标,用三因素三水平的Box-Behnken设计优化发酵条件,三因素为:开始施加超声波的发酵时间、超声波处理时间和一个超声波循环的作用时间。实验获得的最佳超声辅助发酵条件为:在发酵开始的第3.8天施加超声,超声波作用时间65min,一个超声波循环的工作时间/间歇时间25s/5s。在上述最优条件作用下,经过超声波处理的桑黄菌菌丝体胞内多糖(PIPS)的产量为1.8002g/L,与对照(C-PIPS)相比增加了约22.64%。(9)超声波作用前后桑黄菌菌丝体胞内多糖理化性质、分子结构和生物活性的比较。PIPS主要包含较低分子量的多糖(3.1kDa,80%),由葡萄糖,鼠李糖和甘露糖组成,分子摩尔比为11.0:14.0:1.0。PIPS与对照相比糖含量和糖醛酸含量较高并且表现为较强的体外抗氧化能力。(10)超声波作用对桑黄菌菌丝体形貌的影响。利用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察超声波作用前后桑黄菌菌丝体形貌结构特点,结果显示超声波可以改变桑黄菌菌丝体的形貌和结构。该结果暗示了超声波在促进营养物质和代谢产物传递方面发挥了作用。