铁皮石斛Dendrobium officinale Kimuraet Migo为兰科多年生草本植物,亦是一种药用植物,具有润喉明目、生津益胃等功效,其主要药用成分是多糖和生物碱。目前研究表明关于铁皮石斛中生物碱合成可能来源于萜类代谢途径(MVA和MEP途径),而4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-磷酸合成酶(HDS)和异戊烯焦磷酸异构酶(IPI)是MEP途径中的关键酶。本文克隆了铁皮石斛DoHDS和Do IPI cDNA全长序列并进行相关表达分析,旨在研究DoHDS和DoIPI在铁皮石斛萜类代谢的作用,为进一步明确铁皮石斛生物碱的合成途径奠定基础。主要结果如下:(1)采用RT-PCR和RACE等技术获取铁皮石斛DoHDS和DoIPI cDNA全长序列(GenBank登录号,DoHDS:KJ161312;DoIPI:KJ161311)。DoHDS cDNA全长2666bp,含有2238 bp的最大ORF,5-UTR 149 bp,3-UTR 279 bp,编码745个氨基酸;DoIPI cDNA全长1102 bp,含有726 bp的最大ORF,5-UTR 153 bp,3-UTR 223 bp,编码241个氨基酸。(2)利用qRT-PCR技术分析DoHDS和DoIPI在铁皮石斛原球茎、根、茎和叶的表达水平,结果显示DoHDS和DoIPI在各组织中均有表达,其中DoHDS在茎中表达量最高,是原球茎的5.06倍;DoIPI在根中表达量最高,是原球茎的1.93倍。(3)成功构建原核表达载体pET-28a-DoHDS和pET-28a-DoIPI,SDS-PAGE结果显示均成功诱导了融合蛋白的表达。(4)成功构建真核表达载体pCAMBIA1301-DoHDS和pCAMBIA1301-DoIPI,亚细胞定位试验表明DoHDS和DoIPI均定位于叶绿体上。拟南芥ipi突变体生长严重不良,表现为植株矮小,叶片发黄,主根长度缩短,而DoIPI转基因植株的表型有所回复。通过拟南芥突变体互补试验,初步证实DoHDS、DoIPI在萜类生物合成中的作用。