小RNA深度测序鉴定草莓病毒的研究及草莓快繁体系的优化

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草莓是重要的草本果树,果实外观美丽、香气浓郁且营养丰富,口感酸甜中、柔软多汁,备受国内外市场消费者的欢迎。草莓采取无性繁殖,易感病毒病,影响草莓的产量和品质,每年我国草莓因病毒病而减产高达80%。快速、有效的草莓病毒检测鉴定技术及草莓脱毒快繁技术来对保证脱毒效果与质量及脱毒苗的数量具有重要意义。本论文以长沙市疑似病毒病症状的草莓作为试材,对草莓叶片总RNA的提取方法进行了优化,siRNA深度测序技术和RT-PCR检测技术相结合,对长沙市草莓病毒的种类进行了快速而准确的检测鉴定;以草莓组培苗为试材,对草莓组培苗快繁技术进行优化。主要研究结果如下:1、比较了Trizol UP法、Trizol Plant法、CTAB-LiCl法和RNAprep Pure Plant Kit四种方法提取草莓总RNA的效果,用RNAprep Pure Plant Kit方法提取RNA效果较好,有28S、18S和5S条带,28S条带的亮度是18S条带的1.5-2倍,且没有出现降解的二聚体,此法可有效去除多糖,提取草莓片中RNA的质量高,完整性好,产率高,可满足小RNA深度测序要求;CTAB-LiCl法能提取到RNA,只有28S和18S条带,有降解的二聚体,可满足RT-PCR试验要求,且成本明显低于RNArep Pure Kit法;TrizolUP法和Trizol Plant法未能成功提取符合要求的总RNA。2、采用小RNA深度测序技术对长沙市疑似病毒病症状的草莓叶片混合样品进行了测序和生物信息学分析,结果发现了CMV、SVBV、LySV和PRV四种病毒,E-value从小到大依次为CMV、SVBV、LySV和PRV。经RT-PCR验证,只检测出SVBV和CMV两种病毒,未检测出PRV和LySV这两种病毒。3、运用RT-PCR法对长沙地区53个草莓样品病毒感染情况进行检测,结果表明53个草莓样品,有42个样品有检测出CMV,检出率达79.25%,这是在湖南草莓植株上首次检测出CMV,在国内第二次在草莓上检测出CMV;检测出感染SVBV的样品数为10个,SVBV的检出率达18.87%,且全部为CMV、SVBV两种病毒复合侵染,,53个样品均未检测出PRV和LySV。4、对红颜草莓组培苗增殖培养基进行了优化,结果表明红颜草莓组培苗增值的最佳激素配比是6-BA 1mg/L+NAA 0.10 mg/L,增殖系数达10.91。
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