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油菜菌核病（Sclerotinia stem rot）是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）引起的一种危害油菜产量和品质的世界性真菌病害。目前对于此类病害的研究主要集中在病原菌的分离和鉴定、抗病资源的筛选、抗病育种以及QTL（Quantitative trait loci）定位等方面,在转录或转录后水平上研究甘蓝型油菜菌核病的抗病响应分子机制还较少。microRNAs（miRNAs）是一种内源性的单链非编码小分子RNA,主要在转录后水平通过负调控靶基因的表达或抑制靶mRNA的翻译来参与调控植物生长发育和逆境胁迫响应等。迄今为止在miRBase2.10数据库中仅有92条油菜miRNAs的信息,远少于同属十字花科的拟南芥。本实验从以下两个方面来鉴定甘蓝型油菜菌核病抗性相关的miRNAs和基因,通过对差异miRNAs的表达模式及其基因的功能进行分析来探寻其在油菜抗菌核病过程的作用机理,初步揭示甘蓝型油菜和菌核病互作的复杂机制,为油菜菌核病抗病育种和抗病关键基因的克隆和研究提供理论依据。1、对未接种核盘菌（0h）以及接种后48h的甘蓝型油菜抗病种质资源茎秆进行miRNA、转录组和降解组测序,结合生物信息学分析挖掘甘蓝型油菜菌核病抗性相关miRNAs和基因,探究这些miRNAs和基因在甘蓝型油菜应答菌核病胁迫中的功能,主要结果如下:（1）miRNA测序共鉴定出77个已知miRNAs,它们分别属于30个miRNA家族,其中CK-0h和T-48h文库中各有76和68个;共获得176个新miRNAs,其中novelmiR74仅存在CK-0h中,其余新miRNAs均存在于两文库中;51个差异表达miRNAs共预测到122个靶基因,结合GO（Gene Ontology）、COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）功能注释以及转录组测序结果,发现预测的一些甘蓝型油菜miRNAs的靶基因,如bna-miR156a/156f调控的靶基因与SPL转录因子和NPH3家族蛋白相关,bna-miR166f调控的靶基因与REVOLUTA相关,novelmiR173调控的靶基因与TIR-NBS-LRR抗病蛋白相关,novelmiR2和novelmiR73调控的靶基因与类受体蛋白相关,推测这些miRNAs及其靶基因可能参与甘蓝型油菜菌核病的响应过程。（2）转录组测序共检测到7,371个差异表达基因（上调2,215、下调5,156）;将其与植物转录因子数据库（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php）进行比对发现有602个差异基因（上调168、下调434）分别属于39个转录因子基因家族;而与拟南芥激素数据库（http://ahd.cbi.pku.edu.cn/）进行比对发现有685个基因（上调216、下调469）分别属于8种植物激素类别;与GO、COG和KEGG数据库进行比对,筛选出1,570个候选的甘蓝型油菜菌核病抗性相关基因,包括339个蛋白激酶相关基因、118个转录因子、43个信号转导基因、113个转运基因、65个抗病基因、187个激素相关基因、141个次生代谢相关基因、592个其它功能相关基因。（3）降解组测序共检测到80处降解位点,即80个靶基因与41个已知miRNAs和23个新miRNAs相对应。功能分析结果显示,靶基因的切割方式分为Category0和1类,其中大多已知miRNAs靶向SBP、ARF、NAC、TOE等转录调控因子;部分新miRNAs的靶基因是DCL1、TCP和MYB转录因子以及抗病蛋白家族基因。（4）筛选出的部分差异表达miRNAs及其靶基因的实时荧光定量PCR（quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）结果表明,甘蓝型油菜miRNAs负调控其靶基因,且候选的抗病相关差异表达基因的表达趋势与转录组测序结果基本一致。2、以未接菌（0h）以及接菌24h、48h后的甘蓝型油菜抗病和感病种质资源茎秆为样本,构建6个小RNA文库,通过高通量测序和生物信息学分析筛选差异表达miRNAs及其靶基因并对其进行qRT-PCR检测,初步探讨差异表达miRNAs及其靶基因在不同抗病力的甘蓝型油菜菌核病响应过程中的调控机制,主要结果如下:（1）共获得71已知miRNAs,它们分别属于28个miRNA家族,其中除bna-miR6034仅在抗病材料接菌24h后检测到外,其它的已知miRNAs在第二章miRNA测序中同样被检测到,且其表达丰度大致相同;1,402个新miRNAs中部分miRNAs与已知miRNA家族成员的序列保守性较高,推测其可能是这些miRNA家族的新成员。（2）通过对接菌前后抗病或感病材料中miRNAs的表达模式进行分析,发现在抗病和感病材料中分别有569个和680个差异表达的miRNAs,且随着胁迫时间的延长数量有所增加。在接菌24h的抗病甘蓝型油菜中差异表达的miRNAs数量较感病材料要多,而接菌48h又比感病材料略低,表明抗病材料相对于感病材料响应菌核病侵染更迅速;与0h相比,菌核病胁迫48h后在抗病材料中获得的bna-miR156和bna-miR166f在第二章结果中同样差异表达,但差异表达倍数较前文鉴定结果略高。（3）通过对接菌前后抗病和感病材料间miRNAs的表达模式进行分析,发现在未接菌的材料间有29个特异表达的miRNAs,在接菌后的材料间有55个特异表达的miRNAs,并发现特异表达的已知miRNAs（如,bna-miR167a、bna-miR167b、bna-miR167c、bna-miR167d和bna-miR403）均在接菌后的抗病材料中较早表达。（4）靶基因预测和功能注释结果表明,941个差异表达miRNAs所调控的5,667个靶基因,主要涉及植物激素信号转导、次生代谢、胁迫响应、氧化爆发、转录调控以及蛋白转运等途径,其中一些甘蓝型油菜miRNAs的靶基因,如bna-miR172、bna-miR403和novelmir376的靶基因与TIR-NBS-LRR抗病蛋白相关,bna-miR164和bna-miR390调控的靶基因与富含亮氨酸受体蛋白激酶家族蛋白相关,bna-miR393的靶基因是生长素受体、bna-miR160和bna-miR167的靶基因是生长素响应因子,bna-miR168a的靶基因是AGO1蛋白和ZLL等,推测这些miRNA及其靶基因可能与甘蓝型油菜的菌核病抗性相关。（5）结合Pathway分析,共获得了295条代谢途径,分析结果表明油菜在逆境胁迫下会通过miRNAs调节代谢途径中相关基因的表达来提高自身的抗病能力,如bna-miR164a/b/c/d、bna-miR172a/d、bna-miR390a/b/c、bna-miR396a、bna-miR403参与植物和病原菌互作过程,bna-miR172a/d参与次生代谢过程,bna-miR164a/b/c/d bna-miR390a/b/c、bna-miR393、bna-miR394a/b和bna-miR6028参与植物激素信号转导过程等,进一步证明植物的抗病机制是一个非常复杂的过程,它涉及到多个代谢途径的相互协作。（6）对6个候选miRNAs的表达情况进行qRT-PCR检测,同时结合第二章miRNA和转录组测序结果进行验证,发现其在菌核病胁迫下的抗病和感病材料中的表达趋势与测序结果基本一致,其中在接菌后24h的抗病材料中有3个miRNAs的相对表达量高于感病材料,而在接菌后48h有5个miRNAs的相对表达量高于感病材料;相应靶基因的定量结果也表明,miRNAs及其靶基因呈负调控关系。（7）结合本实验以及其它相关研究结果表明,miRNAs参与了甘蓝型油菜菌核病抗病防御过程,这些miRNAs通过负调控其靶基因来启动抗病基因、激活防御和免疫系统以及调节植物信号转导和次生代谢等多种途径来形成植物抗病调控网络,从而抵御病原菌的侵染,且抗性强的材料较抗性弱的材料更能快速做出响应。