目的:慢性脑缺血（chronic cerebral ischemia,CCI）是由于长期的脑血流灌注不足而引起的神经系统疾病,主要临床表现为持久性、进行性的认知和神经功能障碍。其病理机制可能与神经元减少及功能障碍密切相关。目前,临床上主要以药物治疗为主,但疗效欠佳。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）具有自我更新和多向分化及免疫调节等潜能,为多种疾病的细胞治疗和组织再生提供了新的策略。最新研究发现外泌体是MSCs旁分泌作用中一种关键的活性成分,参与机体的免疫应答、抗原提呈、炎症反应、细胞凋亡、组织再生和血管生成等过程,在神经保护、促进神经形成方面具有重要作用。脱落乳牙干细胞（stem cells from exfoliated deciduous teeth,SHED）分离提取于生理性脱落乳牙牙髓组织,是胚胎神经嵴来源的MSCs,具有显著的增殖及神经向分化能力,且来源广泛,获取容易,是极具应用前景的干细胞源。SHED移植对急、慢性的中枢神经系统疾病具有一定疗效,能够促进神经系统创伤修复与再生。但SHED对于CCI的治疗作用与机制尚不清楚。本实验构建CCI大鼠动物模型,进行SHED移植,观察其对于CCI大鼠认知和神经功能障碍的治疗作用,并通过体外实验探究其SHED移植治疗的分子机理,为牙源性干细胞应用于CCI治疗提供理论依据。研究方法:1.分离培养SHED,流式细胞术检测其干细胞表面标记物CD73、CD90、CD105、CD34、CD45的表达,茜素红S和免疫荧光染色等检测其成骨、成神经分化能力。2.大鼠双侧颈总动脉结扎构建CCI大鼠模型,小动物超声、Morris水迷宫及免疫组化等方法对CCI大鼠模型进行鉴定;海马内移植不同浓度SHED,Morris水迷宫检测大鼠的认知能力,Western blot检测海马组织中神经功能相关蛋白BDNF、SYN、PSD95的表达水平。3.HE染色、Nissl染色检测CCI大鼠海马CA1区神经元数量,Tunel染色检测海马CA1区神经元凋亡情况,Western blot检测海马组织中凋亡相关蛋白Caspase 3/Cleaved Caspase 3表达水平;慢病毒转染GFP标记SHED,观察移植后SHED在CCI大鼠海马内的表达情况。4.鼠源性神经母细胞瘤细胞（N2a）建立体外氧糖剥夺（OGD）细胞模型,应用transwell小室将SHED与OGD N2a细胞共培养,CCK-8检测SHED对N2a细胞活性的影响。5.超速离心法提取SHED来源外泌体（SHED-Exo）,透射电镜、纳米颗粒追踪技术、Western blot进行外泌体鉴定;PKH26荧光标记SHED-Exo,观察SHED-Exo被N2a细胞胞吞情况;SHED-Exo处理OGD N2a细胞,慢病毒质粒转染过表达N2a细胞中Fas基因,CCK-8检测N2a细胞活性的变化,Western blot检测N2a细胞凋亡因子Fas、Caspase 3、Cleaved Caspase 3表达水平的变化。实验数据采用SPSS 18.0软件进行统计学分析,P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.SHED表达间充质干细胞表面标记物CD73、CD90、CD105,不表达造血干细胞表面标记物CD45、CD34。体外成骨诱导4周可见矿化结节形成,成神经诱导1周可见神经相关蛋白βIII tubulin、Nestin表达阳性。2.成功建立CCI大鼠模型,小动物超声检查显示CCI大鼠舒张末期两侧颈总动脉无明显血流通过,Morris水迷宫检测显示CCI大鼠学习、记忆能力下降,组织学观察可见CCI大鼠海马CA1区神经元数量减少;不同浓度SHED海马内移植后,Morris水迷宫检测显示SHED移植能够有效减轻CCI大鼠认知功能障碍,其中以2×105个/10μL SHED移植组效果最为明显（P<0.01）;Western blot检测结果显示,与对照组相比,SHED移植后CCI大鼠海马内神经功能相关蛋白BDNF、PSD95、SYN表达水平升高,其中以2×105个/10μL SHED移植组效果最为明显（P<0.01）;SHED海马内移植治疗CCI大鼠的适宜浓度为2×105个/10μL。3.HE、Nissle染色显示,与假手术组相比,CCI大鼠海马CA1区神经元数量减少,细胞分布不均,核膜欠完整,部分核膜出现皱缩,细胞出现凝固性坏死及细胞脱失;SHED移植后神经元数量、形态、分布趋于正常;Tunel染色可见CCI大鼠海马CA1区存在大量神经元凋亡,SHED移植后神经元凋亡数量显著下降（P<0.01）;Western blot检测结果显示,与对照组相比,SHED移植后海马组织凋亡相关因子Caspase 3、Cleaved Caspase 3的蛋白表达水平明显降低（P<0.01）;免疫荧光染色观察GFP-SHED移植后5天,CCI大鼠海马组织内GFP未见明显阳性表达。4.CCK-8检测显示体外氧糖剥夺（5%CO2,3%O2,92%N2,无糖无血清培养）4 h时N2a细胞存活率约为50%,以此作为慢性缺氧N2a细胞模型;与模型组相比,与SHED共培养后的N2a细胞活性明显上升（P<0.01）。5.SHED-Exo呈双层膜杯盘状结构,粒径大小为30-120 nm,阳性表达CD9、Alix;示踪观察见PKH26荧光标记的SHED-Exo被N2a细胞胞吞,大量聚集在N2a细胞胞浆内;CCK8检测结果显示SHED-Exo上调OGD N2a细胞活性（P<0.01）;Western blot检测结果显示,与对照组相比,OGD N2a细胞Fas蛋白表达水平上升（P<0.01）,SHED-Exo下调细胞内Fas蛋白表达水平(P<0.01;N2a细胞慢病毒转染Fas基因后,与SHED-Exo治疗组相比,SHED-Exo上调OGD N2a细胞活性作用减弱（P<0.01）,凋亡相关因子Fas、Caspase 3、Cleaved Caspase 3蛋白表达水平显著升高（P<0.01）,SHED-Exo抑制细胞凋亡作用减弱。结论:SHED移植有效减少CCI大鼠海马区神经元细胞凋亡,恢复神经元功能,缓解大鼠认知功能障碍;SHED通过旁分泌外泌体提高缺氧神经元细胞活性,其外泌体能够被受损神经元细胞胞吞,下调细胞凋亡蛋白Fas表达,抑制细胞凋亡,恢复神经元功能。