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目的 利用克隆形成试验，研究大豆异黄酮主要成分Genistein对离体培养雄激素非依赖型DU145前列腺癌细胞的生长抑制作用并测定其半数抑制常数(IC50)；通过Genistein与辐射联合应用来观察前者对DU145细胞放射敏感性的影响，并对其可能产生的放射增敏作用的机理进行探讨，以尝试一种针对雄激素非依赖型前列腺癌的治疗新方法。 材料与方法 雄激素非依赖型DU145前列腺癌细胞在克隆形成试验中，接受不同浓度(0，5，10，15，20，25，30，35，40，45和50μmol／L)的Genistein处理，比较DU145细胞的克隆形成率，从而得出Genistein作用于DU145细胞的IC50；DU145细胞在经过不同浓度(0，5，15和30μmol／L)Genistein处理后分别接受梯度剂量辐射(0，1，3和5Gy)，观察最终的克隆形成率，以判断各种浓度Genistein对DU145细胞放射敏感性的影响；用TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling；末端脱氧核糖核酸转移酶介导3’-OH末端标记)和DAPI(4-6-二氨基-2-苯基吲哚)染色法检测细胞凋亡，进行凋亡细胞的形态学观察，并用DNA ladder(DNA凝胶电泳)进行凋亡细胞的半定量测定；流式细胞仪用于分析各种处理后细胞周期改变，并对同时伴随的凋亡细胞及超二倍体细胞(hyperdiploid)波峰进行观察；免疫印迹法(immulloblotting浙江人学博卜学位论文or westem一blotting)用于检测细胞周期相关蛋白包括周期素BI、cde一2和p21c，p，的表达。 结果 通过分析各种浓度Genistein作用后DU145细胞的克隆形成率，得出Genistein作用于DU 1 45细胞的IC50约为30“mol/L。克隆形成试验进一步显示，Genistein在较低或中等浓度(5，15 pmol/L)下即可提高DU145细胞的放射敏感性。单独辐射和/或合用Genistein后24h，DNA ladder提示细胞凋亡主要见于高浓度Ge拍stein(100pmol几)处理组，72h后凋亡亦见于较低浓度Genistein组(30 p mol几)。形态学上，TU]呵EL分析显示凋亡细胞表现为红色背景下的绿色或黄色荧光，且细胞形态相对较小，而DAPI染色亦呈现核浓缩、核碎裂和凋亡小体形成等凋亡征象。Genistein单独使用后可导致DU145细胞GZ/M期细胞周期阻滞，后者随着Genistein作用浓度的增加而增加，同时伴之于GO/GI期或S期细胞的相应减少;辐射(6 Gy)亦能轻微增加GZ从期细胞;30 p mol/L及以下浓度Genistein与辐射合用后能进一步增加GZfM期细胞，但当浓度上升至100 p mol/L时，相对于单独使用Genistein，Genistein合用辐射反而减少了GZ/M期细胞，同时伴有S期细胞的相应增加;在30 pmol几浓度Genistein与辐射合用组，延长观察时间发现上述GZ/M期细胞周期阻滞大部得到了维持，同时伴有凋亡和超二倍体细胞群的明显增加。细胞周期相关蛋白分析提示，Genistein单独处理24h后，周期素Bl呈现双相变化，即起初随着Genistein作用浓度的上升周期素Bl逐渐增加，并在大约30协mol几时达到峰值，100 p mol几时则继而明显减少;单独辐射亦能显著增加周期素Bl的表达，辐射与Genistein合用时其变化规律类似于Genistein单独使用时;相对于周期素BI，cdc一2变化较小;pZ Ic‘p’则随oenistein作用浓度的上升而稳步增加，且不依赖于p53表达，单独辐射亦能轻微增加pZI ciPI，Genistcin与辐射合用时其变化类似于Genistein单独使用时。浙江人学博卜学位论文 讨论 我们的研究结果显示较低浓度Genistein作用下即可增加DU145细胞的放射敏感性;早期细胞凋亡主要依赖于高浓度Genistein作用，而迟发凋亡亦可在低浓度下发生，尤其当与辐射合用时;Genistein与辐射合用可使更多细胞阻滞于GZ从期，同时随着作用时间的延长伴有超二倍体细胞的明显增加，这也可能是Genistein放射增敏作用的机理之一。 本研究显示早期细胞凋亡主要取决于Genistein作用浓度而不是辐射，提示DU145细胞对辐射诱导凋亡具有抵抗性。肿瘤辐射抵抗性的机理未曾明了，可能与一些基因表达有关，如辐射可诱导NF一kapPaB的产生，后者具有抗凋亡作用。有报道认为Genistein可抑制前列腺癌的NF一kapPaB激活，这也许可部分解释随着作用浓度的升高或作用时间的延长Genistein能诱导DU145细胞的凋亡，尤其当与辐射合用时。结合细胞周期观察结果，我们推测这其中部分凋亡细胞可能来自持续阻滞的GZ从期细胞或超二倍体细胞群。 GZ/M调停点(cheek一poini)被认为是肿瘤细胞辐射和化疗敏感性的主要决定因素，本实验结果显示，与单纯使用Genistein相t匕，中低浓度Genistein(5一30 p mol/L)与辐射(6 Gy)合用后可导致更多细胞阻滞于02/M期，但高浓度Genistein(100 p mol几)合用辐射不能进一步增加，而是减少了GZ/M期阻滞细胞，这可能由于合用后有更多的GZ彻期阻滞细胞进入了凋亡，同时S期细胞的增加亦可能部分反映了GZ期前凋亡(pre一GZapoPtosis)现象。此外，当延长观察时间至48h和72h，辐射合用Genistein组不但有细胞凋亡，而且还有超二倍体细胞的明显增加。超二倍体现象