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甾醇14α-去甲基化酶(Sterol 14α-demethylase,CYP51属于细胞色素P450超家族成员,是生物甾醇合成过程中的一种关键酶,广泛分布于古细菌,真菌,植物及动物中,能够选择性催化甾醇前体C-14位的去甲基反应。目前P450新酶的挖掘及体外催化活力的探究已成为研究热点。鉴于P450酶参与的氧化还原反应体系往往依赖特定的电子传递链负责将辅酶中的电子传递至P450酶的亚铁红素结构域,而低效的电子传递系统往往成为反应的限速步骤,高效耦合的电子传递链的筛选也是目前P450酶体系研究的热点问题。作为一种经典的单加氧酶,对CYP51酶的基因挖掘,重组克隆表达及体外催化活性的研究能够为深入了解P450酶及其电子传递链的催化机制提供较好的理论基础,另外,搭建CYP51及其电子传递链搭建的体外选择性催化底物羟基化及去甲基化反应能够突破化学催化的选择性限制。本课题以羊毛甾醇为底物,旨在挖掘CYP51新酶及其高效耦合的电子传递系统,利用CYP51酶系构建选择性催化羊毛甾醇C-14去甲基反应的生物催化反应体系,具体内容如下:本论文的第一部分内容通过已报道文献及多序列比对结果,从原核生物中筛选了分别来源于耻垢分枝杆菌的CYPMs(Mycobacterium smegmatis);红球菌属的CYPRt(Rhodococcus triatomae)及来自甲基微菌属的C端融合了Fdx的融合蛋白CYPMb(Methylomicrobium buryatense)作为研究对象。此外,本论文同时选择了三套电子传递系统:包括来源于不动杆菌(Acinetobacter sp.OC4)铁氧还蛋白还原酶-铁氧还蛋白FdR-Fdx;大肠杆菌属(Escherichia coli,K-12 substr.MG1655)的黄素氧还蛋白还原酶Fdr2及黄素氧还蛋白Fld;诺卡氏菌属(Nocardiaceae)的NfFdr。本论文第二部分内容构建了三种CYP51及电子传递组分(FdR、Fdx、FdR-Fdx、FdR2、Fld、NfFdr)的重组表达载体,并导入受体细胞E.coli BL21(DE3)中进行异源表达,通过表达条件的优化,实现了CYP51及其电子传递链组分的可溶表达。本论文第三部分内容对CYP51及其电子传递链组分蛋白的特征吸收光谱及体外电子传递效率进行了评估。首先通过镍柱纯化,获得了CYP51及FdR、Fdx、FdR-Fdx、FdR2、Fld、NfFdr的电泳纯蛋白。利用CO差光谱法测定了三种CYP51酶的特征光谱,其中CYPRt与CYPMs在420 nm的天然吸收峰,且还原态与CO结合在450 nm形成特征吸收峰,证实其亚铁血红素结构域被正确折叠,但CYPMb未发现此特征吸收峰。进一步利用DCIP及细胞色素C为人工电子受体评价了三套电子传递链组分的生物学功能。确定FdR偏好于NADH,FdR2偏好于NADPH。以DCIP为电子受体,根据米氏方程测得FdR米氏常数为34.4+/-2.85μM;测得FdR2的米氏常数为77.14μM。以细胞色素C为电子受体,进一步评价了电子传递链各组分的偶联活性,测得FdR、Fdx最佳浓度比为1:5,FdR2、Fld的最佳浓度比为5:7。以活力最高的FdR、Fdx作为100%,FdR-Fdx相对活力为60%,FdR2、Fld相对活力为75%,NfFdr相对活力最低,仅为5%。从而确立了两套活性较高的CYP51酶及其耦合效率较高的电子传递组分,分别为CYPMs+FdR2+Fld及CYPRt+FdR+Fdx。本论文第四章内容建立了体外催化羊毛甾醇C-14位去甲基反应体系。以辅酶的消耗速率为基础,优化了CYP51酶系的催化反应条件,确定了CYPMs+FdR2+Fld的最佳缓冲系统为磷酸盐缓冲液,最佳催化温度为30℃,最佳底物浓度为200μM,CYPMs、FdR2、Fld的最佳浓度比为1:2:3。CYPRt+FdR+Fdx的最佳缓冲液为磷酸盐缓冲液,最佳催化温度为37℃,最佳底物浓度为250μM,CYPRt、FdR、Fdx的最佳浓度比为1:2:10或1:2:3。通过气相质谱联用仪对催化结果进行检测,测得CYPMs的转化率为9.2%,CYPRt的转化率为7.8%。