[研究背景]分化抑制因子(inhibitor of DNA differentiation, Id) Id蛋白可与碱性螺旋-环-螺旋(Basic helix-loop-helix)转录因子作用,形成非活性异二聚体,阻止bHLH与靶基因DNA上的E启动子结合,间接地抑制分化相关基因的表达,影响肿瘤细胞的生长、血管形成、侵袭及转移能力,其中Id1/Id3具有许多重叠效益,在促进肿瘤细胞增殖和侵袭转移方面具有协同作用,被认为是与肿瘤侵袭性相关的上游调控基因。近年来,基因治疗、靶向治疗作为肿瘤治疗的新生代模式日益受到重视。但目前对于子宫内膜癌的治疗还没有发现特有效的特异性标志物,对于生长转移的分子机理也缺乏一定的了解。关于Id1/Id3基因与子宫内膜癌发生、发展及侵袭转移的关系还没有相关研究。我们希望借此研究子宫内膜癌生物学行为的发生、发展及浸润转移机制,寻找一种新的治疗策略。[研究目的]检测Id1/Id3在子宫内膜癌组织中的表达情况。利用RNA干扰技术构建Id1/Id3双敲低腺病毒并感染人子宫内膜癌细胞株HEC-1-B和RL-952,通过观察Idl/Id3双敲低后,对MMP2, CXCR4和P21在基因水平和蛋白水平的影响,推测Idl/Id3与P21、MMP2和CXCR4的关系,以及是否参与它们介导的细胞存活、细胞增殖或趋化相关信号转导通路,研究子宫内膜癌细胞的浸润、增生及转移的机制。重点探讨双敲低Idl/Id3基因对子宫内膜癌细胞增殖能力、侵袭能力、迁移能力及粘附能力的影响,阐明Idl/Id3基因在子宫内膜癌生长转移中的生物学作用,检验干扰Idl/Id3是否可以有效治疗子宫内膜癌,为临床诊断和治疗提供理论依据。[研究方法]1. Western blot检测Id1、Id3在子宫内膜癌组织内表达：将随机挑选的南方医科大学南方医院妇产科2011年6月-2011年10月住院手术的4例子宫内膜癌患者新鲜组织及相应的癌旁组织提取全蛋白,根据BCA蛋白定量试剂盒进行定量,测定其在562nm处的吸收值(A562)。计算各浓度蛋白标准的平均吸光度,绘制标准曲线,计算回归方程。提取的总蛋白,加入2xSDS蛋白上样缓冲液(按1：1比例),100℃煮沸5min,-20℃保存备用。Western blot方法检测后观察凝胶图像,应用Adobe Photoshop图像软件扫描Western blot凝胶图片,得到相应灰度值,观察4例子宫内膜癌组织及相应的癌旁组织中的Idl/Id3的表达。2. qRT-PCR检测不同腺病毒载体感染子宫内膜癌HEC-1-B和RL-952细胞株后Id1、Id3、MNP2、CXCR4. P21mRNA水平：实验将两株细胞各分为未处理细胞组(简写control)、空白病毒组(vector)、启动子病毒组(promoter)、Id1/Id3双敲低组(RNAi)。对四组细胞进行提取RNA、去基因组、纯度检测和电泳检测、逆转录及定量PCR操作。采用△△CT法对荧光定量PCR结果进行定量分析,计算Idl/Id3双敲低后MMP2、CXCR4、P21的表达抑制率。3. Western blot检测不同腺病毒载体感染子宫内膜癌HEC-1-B和RL-952细胞株后Idl、Id3、MMP2、CXCR4、P21蛋白表达量：对每株细胞的各四组细胞提取全蛋白,具体步骤同前。4.噻唑蓝(MTT)比色实验检测不同重组腺病毒载体感染子宫内膜癌细胞株RL-952和HEC-1-B后对细胞增殖能力的影响：对RL-952及HEC-1-B细胞株各四组细胞加入MTT后,以空白对照孔调零,酶联免疫监测仪上490nm测定各孔光吸收值(D值)。各组取三孔平均值,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。实验重复3次。5.移行小室(Transwell)侵袭实验检测不同重组腺病毒载体感染子宫内膜癌细胞株RL-952和HEC-1-B后对细胞侵袭能力的影响,一般随机选取6个高倍视野计数穿过膜的细胞数。6.细胞划痕实验检测不同重组腺病毒载体感染子宫内膜癌细胞株RL-952和HEC-1-B后对细胞迁移能力的影响：按0h,6h,12h,24h,48h取样,以未处理的细胞为对照,拍照后使用phoshop的标尺测量致伤区域的像素。7.细胞粘附实验检测不同重组腺病毒载体感染子宫内膜癌细胞株RL-952和HEC-1-B后对细胞粘附能力的影响：细胞拍照后经过MTS法处理,每小组做6个复孔。8.统计学处理采用SPSS14.0统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示,4例子宫内膜癌组织及相应的癌旁组织中Id1/Id3表达的比较采用两独立样本t检验,其余实验组间比较采用ANOVA单因素方差分析,两两比较采用Tamhane’s T2检验；检验水准a=0.05。以P<0.05为有统计学差异。[结果]1.Idl在4例子宫内膜癌组织中表达上调,与癌旁组织中表达量相比具有统计学差异(F=9.656t=0.000)；Id3在子宫内膜癌组织中表达亦上调,与相应癌旁组织中表达量相比具有显著性差异(F=14.600t=0.000)。2.对于HEC-1-B细胞,Idl/Id3双干扰后,Idl mRNA表达水平明显抑制(F=283.920P=0.000), Id3mRNA表达水平明显抑制(F=318.073P=0.000), CXCR4mRNA表达量明显抑制(F=185.749P=0.000), MMP2mRNA表达量明显抑制(F=57.383P=0.000), P21mRNA表达量升高(F=37.590P=0.000)。对于RL-952细胞,Idl/Id3双干扰后,Id1mRNA表达抑制(F=211.715P=0.000), Id3mRNA表达抑制(F=228.218P=0.000), CXCR4mRNA表达水平降低(F=99.462P=0.000), MMP2mRNA表达水平降低(F=19.060P=0.001), P21mRNA表达水平升高(F=104.071P=0.000)。3.对于HEC-1-B细胞,Idl/Id3双干扰后,Id1蛋白表达明显抑制(F=454.836P=0.000), Id3蛋白表达明显抑制(F=34.112P=0.000), CXCR4蛋白表达抑制(F=510.178P=0.000), MMP2蛋白表达抑制(F=286.765P=0.000), P21蛋白表达升高(F=1757.754P=0.000)。对于RL-952细胞,Idl/Id3双干扰后,Id1蛋白表达抑制(F=882.161P=0.000), Id3蛋白表达抑制(F=1190.847P=0.000), CXCR4蛋白表达抑制(F=963.998P=0.000), MMP2蛋白表达抑制(F=145.342P=0.000),P21蛋白表达升高(F=4799.080P=0.000)。除P21Idl/Id3双敲低组与启动子组比较无统计学差异(P=0.998)外,RNAi与其他组相比均有统计学意义。4.噻唑蓝(MTT)比色试验检测证实双敲低Idl/Id3表达后抑制HEC-1-B和RL-952细胞的增殖能力：HEC-1-B细胞转染病毒12h后,经统计学分析,未处理细胞组、空白病毒组、启动子组和Id1/Id3双敲低组均数相比具有显著性差异(F=19.358P=0.001)；转染24h后四组均数相比具有显著性差异(F=26.536P=0.000)；转染48h后均数相比具有显著性差异(F=30.078P=0.000)RL-952细胞转染病毒12h后,经统计分析,四组均数相比具有显著性差异(F=4.557P=0.038)；转染24h后四组均数相比具有显著性差异(F=14.059P=0.001)；转染48h后四组均数相比具有显著性差异(F=28.356P=0.000)；绘制生长曲线可见干扰Idl/d3表达后,细胞的生长活力明显降低,且在48h时间点增殖能力最低。5. Transwell侵袭实验检测证实双敲低Idl/Id3表达后抑制HEC-1-B和RL-952细胞的侵袭能力：未处理细胞组、空白病毒组、启动子组和Idl/Id3双敲低组穿膜到达下室的HEC-1-B细胞数均数经统计学分析存在显著性差异(F=79.116P=0.000),且RNAi组细胞数最低,与其他三组比较均有显著性差异(P<0.001)；四组穿膜到达下室的RL-952细胞数均数存在显著性差异(F=85.899P=0.000),且RNAi组与其他三组比较有统计学意义(P<0.001)。6.细胞划痕实验检测证实双敲低Idl/Id3表达后抑制HEC-1-B和RL-952细胞的迁移能力：对于RL-952细胞,划痕6h后四组之间迁移率有显著性差异(F=124.307P=0.000),划痕12h后四组之间迁移率有显著性差异(F=106.879P=0.000),划痕24h后四组之间迁移率有显著性差异(F=25.808P=0.000),划痕48h后四组之间迁移率有显著性差异(F=49.600P=0.000),且划痕48h后,RNAi组与其他三组相对比迁移速度最慢,迁移距离最小,划痕距离并未见明显缩小,P<0.001,有统计学意义。对于HEC-1-B细胞,划痕6h后四组之间迁移率有显著性差异(F=51.267P=0.000),划痕12h后四组之间迁移率有显著性差异(F=15.869P=0.001),划痕24h后四组之间迁移率有显著性差异(F=15.179P=0.001),划痕48h后四组之间迁移率有显著性差异(F=51.066P=0.000),且划痕48h后,RNAi组与其他三组相对比迁移速度最慢,迁移距离最小,划痕距离并未见明显缩小,P<0.05,有统计学意义。7.细胞粘附实验证实双敲低Idl/Id3表达后能够抑制HEC-1-B和RL-952细胞的粘附能力：RL-952细胞中未处理细胞组、空白病毒组、启动子组和Idl/Id3双敲低组D值相比存在显著性差异(F=40.314P=0.000),且经统计学分析RNAi组与其他三组比较均有统计学意义；HEC-1-B细胞中,四组D值相比存在显著性差异(F=48.945P=0.000),且Idl/Id3双敲低组与未处理细胞组、空白病毒组和启动子组比较均有显著性差异。[结论]Idl/Id3在子宫内膜癌组织中高表达,与癌旁组织中的表达量相比具有显著性差异,成为我们检验抑制Idl/Id3是否可以有效治疗子宫内膜癌的依据。2.双敲低Id1/Id3后,MMP2和CXCR4在mRNA水平及蛋白水平表达均降低,P21在mRNA水平及蛋白水平表达均升高,较未经任何处理的子宫内膜癌细胞有显著性差异。我们推测Idl/Id3能够在基因及蛋白水平明显升调MMP2和CXCR4的表达,降调p21的表达,从而上调细胞周期蛋白CDK2、Cyclin E、 CDK1、Cyclin B的表达,进而上调非磷酸化Rb蛋白表达,促进子宫内膜癌细胞的增殖、血管生成、侵袭与转移。可见,Idl/Id3为P21、MMP2和CXCR4的上游调控基因,可参与它们介导的细胞存活、细胞增殖或趋化相关信号转导通路,抑制子宫内膜癌细胞的浸润、增生及转移。3. Id1/Id3双敲低后,子宫内膜癌细胞株的增殖能力、侵袭能力、迁移能力及粘附能力明显抑制。总之,Idl/Id3在子宫内膜癌的发生发展中发挥重要作用,可作为子宫内膜癌基因治疗的靶点,但是Idl/Id3在子宫内膜癌中的详细作用机制仍需要进一步研究。